Cbl-b基因沉默對TRP-2肽疫苗免疫小鼠淋巴細胞體外殺傷B16F10黑色素瘤細胞的影響.pdf

1、惡性黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，臨床上迫切需要新型的治療策略。治療性疫苗是一種極具發(fā)展前景的生物治療方法，但目前臨床有效率仍較低。近年來研究發(fā)現(xiàn)泛素連接酶Cbl-b是調節(jié)T細胞活化的關鍵分子，直接參與了T細胞的活化及免疫耐受過程，在避免免疫無能、維持外周T細胞耐受力方面具有重要作用。本文首先構建Cbl-b基因特異性siRNA和shRNA真核表達載體，篩選siRNA高效轉染的方法，轉染經肽疫苗體內免疫過的小鼠原代淋巴細胞，誘導淋巴細胞

2、Cbl-b基因沉默，進而檢測小鼠原代淋巴細胞體外免疫活性狀態(tài)及細胞因子分泌情況的改變，并探討肽疫苗免疫淋巴細胞和B16F10黑素瘤細胞系體外共培養(yǎng)時，Cbl-b沉默對淋巴細胞殺傷腫瘤細胞作用的影響。
　　第一部分:Cbl-b基因ShRNA干擾載體的構建及效果評價
　　目的:構建小鼠Cbl-b基因RNA干擾(RNAi)的真核表達質粒，并初步鑒定其干擾效果，為后續(xù)研究奠定基礎。
　　方法:根據(jù)GenBank提供的Cbl-b

3、 cDNA序列，設計并合成4對短發(fā)夾結構的互補DNA序列，克隆至載體PGPU6/GFP/Neo構建重組質粒，并予以DNA測序鑒定。重組干擾質粒構建成功后，將干擾質粒與Cbl-b過表達載體共轉染293T細胞，于轉染后48h通過實時熒光定量PCR法及蛋白質印記法檢測各質粒對Cbl-b基因的表達抑制效應。
　　結果:測序分析證實四對shRNA寡核苷酸序列分別成功插入至shRNA真核表達載體PGPU6/GFP/Neo中，將構建成功的PGP

4、U6/GFP/Neo-shRNA質粒與Cbl-b的真核表達載體共轉染細胞48h后，通過熒光實時定量PCR法及westernblotting發(fā)現(xiàn)四條shRNA序列對Cbl-b的表達均有一定的抑制效應，其中以1號shRNA序列對Cbl-b表達的抑制程度最高(p＜0.05)。
　　結論:成功構建并篩選出沉默效應最高的Cbl-b shRNA真核細胞表達載體，為進一步研究Cbl-b沉默后作用奠定了基礎。
　　第二部分:小鼠原代淋巴細胞

5、轉染方式選擇
　　目的:探討小鼠原代淋巴細胞siRNA轉染的有效方法。
　　方法:從小鼠脾臟和淋巴結分離原代淋巴細胞，優(yōu)化培養(yǎng)體系，采用siRNA+Lipofectamine2000、慢病毒載體+polybrane、慢病毒載體+EnvirusTM-LV及siRNA+EntransterTM-R四種方式轉染小鼠淋巴細胞，通過熒光顯微鏡觀察及流式細胞術檢測進行轉染效率評價。
　　結果:采用上述4種轉染放方法介導轉染小鼠原代

6、淋巴細胞，慢病毒+polybrane轉染后96小時熒光顯微鏡下只可見稀疏熒光信號，轉染效率低于5％;脂質體、慢病毒+ EnvirusTM-LV幾乎未見明顯熒光信號，而采用
　　siRNA+EntransterTM-R轉染24 h后熒光顯微鏡下熒光信號明顯強于前三者，采用EntransterTM-R轉染100及50 nmol/L siRNA，24 h后轉染效率分別為43.1％和22.8％:
　　結論: siRNA+ Entra

7、nsterTM-R4000可有效轉染小鼠原代淋巴細胞。
　　第三部分:Cbl-b基因沉默聯(lián)合肽疫苗對小鼠原代淋巴細胞體外殺傷B16F10黑素瘤細胞作用的影響
　　目的:觀察Cbl-b基因特異性小干擾RNA(siRNA)沉默Cbl-b基因對于小鼠原代淋巴細胞免疫活性影響。
　　方法:用SVY肽疫苗體內免疫C57BL/6小鼠，取脾和淋巴結梯度離心分離淋巴細胞，體外用SVY肽和IL-2刺激淋巴細胞增殖，應用Entranste

8、rTM-R4000將Cbl-b基因特異性SiRNA轉染小鼠原代淋巴細胞，轉染48 h后細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒檢測淋巴細胞增殖程度，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清中INF-γ及TNF-α的分泌量;CCK8法檢測混合培養(yǎng)體系中淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷活性。
　　結果:特異性Cbl-b siRNA能有效沉默淋巴細胞Cbl-b基因;轉染48 h后，CCK-8試劑盒檢測Cbl-b siRNA轉染組、NC轉染

9、組的吸光度值分別為1.246±0.063和0.906±0.039，差異有統(tǒng)計學意義;轉染后淋巴細胞培養(yǎng)液中INF-γ分泌量，轉染組為95.80±17.85，轉染陰性對照組為49.92±9.89，差異有統(tǒng)計學意義;轉染后淋巴細胞培養(yǎng)液中TNF-α的分泌量轉染組為62.23±4.409，顯著高于轉染陰性對照組32.29±2.099，差異有統(tǒng)計學意義;淋巴細胞殺傷活性檢測結果顯示轉染組殺傷活性明顯高于轉染陰性對照組。
　　結論:利用特異