采用基于CDR3δ肽結(jié)合特性的免疫—生物化學(xué)技術(shù)策略鑒定TCRγδ所識別的新型配體——hMSH2蛋白.pdf

1、盡管人類外周血γδT細胞在整個T細胞群體中所占比例較少，但其在機體對抗感染和腫瘤的免疫應(yīng)答中的重要作用卻深受關(guān)注。然而，至今為止，γδT細胞所識別的抗原則很少被鑒定。不了解T細胞受體(TCR)γδ所識別配體，也就不可能深入了解γδT細胞的生物學(xué)功能。因此，進一步發(fā)現(xiàn)和鑒定TCRγδ所識別配體則成為γδT細胞研究領(lǐng)域亟待解決的突出問題。如何通過新的技術(shù)策略，來發(fā)現(xiàn)TCRγδ所識別新型配體是本研究著重考慮的科學(xué)問題，這也是進一步了解TCRγ

2、δ抗原識別特異性和多樣性機制，揭示γδT細胞的生物學(xué)功能的關(guān)鍵問題。 TCR的抗原結(jié)合部位是由六個抗原決定簇(CDR)形成的，這六個CDR在識別抗原時作用是不相同的，其CDR3區(qū)在抗原識別時占有主導(dǎo)地位。鑒于TCR8 CDR3區(qū)(CDR38)與抗體重鏈的CDR3區(qū)在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，因此，我們提出了CDR3δ的一級結(jié)構(gòu)是決定TCRγδ識別抗原特異性的關(guān)鍵部位的學(xué)術(shù)假說。這一假說已為我們實驗室前期工作所驗證。我們根據(jù)卵巢上皮癌

3、(OEC)組織浸潤的γδT。細胞(γδTIL)TCR的一個CDR3δ的基因序列(OT3)，人工合成了OT3肽，并通過體外一系列OT3肽與靶細胞、靶組織或來源于靶細胞的蛋白的體外結(jié)合實驗，驗證OT3肽的結(jié)合特異性，所采用的方法包括OT3肽介導(dǎo)的生物傳感器，免疫熒光技術(shù)，酶免疫技術(shù)和OT3肽競爭結(jié)合實驗。同時，構(gòu)建了用OT3序列替代抗體重鏈CDR3區(qū)序列的OT3移植抗體OT3Ab，也進行相應(yīng)實驗。本研究又重復(fù)了部分上述驗證工作。結(jié)果顯示，O

4、T3肽和OT3Ab在對靶細胞、靶組織或來源靶細胞的蛋白的結(jié)合活性上享有相似的特異性。這就證明了CDR3δ確實在TCRγδ抗原識別特異性上起關(guān)鍵作用，也提示OT3肽能作為一個特異的探針，去篩選TCRγδ識別的抗原。 在上述驗證工作的基礎(chǔ)上，本研究共采用了三種技術(shù)策略去尋找TCRγδ識別的蛋白抗原：一是以O(shè)T3肽為探針在噬菌體隨機展示十二肽庫中篩選與OT3肽結(jié)合的十二肽，通過序列比對獲得相應(yīng)蛋白；二是以O(shè)T3肽為探針在人卵巢癌cDN

5、Aλ噬菌體表達文庫篩選與OT3肽結(jié)合的克隆，通過測序鑒定蛋白；三是通過OT3肽偶聯(lián)的親和層析，從OEC腫瘤細胞系(SKOV3細胞)的總蛋白中分離與OT3肽特異性結(jié)合的蛋白，再利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白的種類。應(yīng)用第一種技術(shù)策略，我們獲得了三個OT3肽特異結(jié)合的十二肽。結(jié)合和功能驗證實驗結(jié)果顯示，這些十二肽不但能特異性地結(jié)合TCRγδ，還能在體外促進γδT細胞活化，提示這些十二肽具有TCRγδ的表位肽活性。然而，在BLAST比對中未發(fā)現(xiàn)與這些多

6、肽在序列上相匹配的人類相關(guān)蛋白，提示這些十二肽可能為來源于其它種屬的表位肽。篩選人卵巢癌cDNAλ噬菌體表達文庫要求探針具有較高的特異性和親和力，在這兩方面OT3肽不如一般的抗體，因此第二種策略也失敗了。通過第三種策略，我們成功鑒定了三個TCRγδ識別的腫瘤相關(guān)抗原，它們是丙酮酸激酶3，人mutS同源蛋白2(hMSH2)和熱休克蛋白(HSP)60。由于已有報道HSP60能被TCRγδ所識別，故鑒定出HSP60表明我們的策略是可行的。而丙

7、酮酸激酶3以及與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的hMSH2可能是TCRγδ識別的新的蛋白抗原。 本研究就hMSH2是否為TCRγδ配體這一問題進行了驗證。RT-PCR結(jié)果顯示，在卵巢癌細胞系SKOV3中，hMSH2 cDNA存在散在分布的點突變。SKOV3細胞培養(yǎng)上清中檢測到分泌形式的hMSH2。用Western blotting在SKOV3細胞總蛋白中還發(fā)現(xiàn)一個60kD的hMSH2的缺失突變表達形式。而且，在包括SKOV3細胞在內(nèi)的很多腫

8、瘤細胞系細胞膜上均檢測到hMSH2的表達。免疫組化結(jié)果證明，腫瘤組織中也有異位表達的hMSH2。另外，Vδ2 γδT細胞對SKOV3細胞的細胞毒活性也能被抗hMSH2抗體部分封閉。 同時，本研究還構(gòu)建和表達了五種重組的hMSH2蛋白，包括hMSH2全長蛋白，分別含hMSH2 N端兩個結(jié)構(gòu)域和C端兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白片段，以及SKOV3細胞表達的含有散在突變的兩個分段蛋白。所有的這五個蛋白都能特異性與Vδ2γδT細胞結(jié)合，并刺激其活化

9、增殖，分泌γ干擾素，并且促進Vδ2γδT細胞對靶細胞的殺傷活性。此外，本研究還利用昆蟲病毒表達系統(tǒng)，得到了比原核大腸桿菌表達系統(tǒng)更具生物活性的hMSH2蛋白，這為hMSH2蛋白進一步結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究取得了以下學(xué)術(shù)成果： l、證明了CDR3δ在決定TCRγδ識別抗原特異性上的關(guān)鍵作用，TCRγδ識別抗原時僅僅依賴CDR3δ一級結(jié)構(gòu)的特異性，因此人工合成的CDR3δ肽OT3是尋找TCRγδ抗原的很

10、奏效的探針； 2、建立了一個采用基于CDR3δ肽結(jié)合特性的免疫.生物化學(xué)技術(shù)策略鑒定TCRγδ所識別的蛋白抗原的新的有效的方法； 3、首次發(fā)現(xiàn)在癌變的情況下，異位表達的hMSH2很可能是一個新的Vδ2γδT細胞所識別的腫瘤配體分子，其生物學(xué)意義在于對固有免疫系統(tǒng)的預(yù)警作用； 4、證明了昆蟲病毒表達系統(tǒng)是一個穩(wěn)定而有效的真核表達系統(tǒng)，在昆蟲細胞中能完成很多翻譯后的修飾，在使表達的外源蛋白保有天然蛋白的生物學(xué)活性上至