靶向IL-1Ra基因拮抗兔膝關(guān)節(jié)炎的作用機理研究.pdf

1、目的：探討單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型載體介導白細胞介素1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)對兔膝骨關(guān)節(jié)炎的局部治療作用及機制。
　　 方法：48只新西蘭大白兔隨機分為手術(shù)造模組(n=24只)和假手術(shù)造模組(n=24只)采用改良Hulth法建立兔膝關(guān)節(jié)炎模型。構(gòu)建單純皰疹病毒Ⅰ型載體介導IL-1Ra表達的重組質(zhì)粒(pHSV-IL-1Ra-LacZ)注射到實驗兔模型關(guān)節(jié)腔，pHSV-LacZ空白載體設(shè)為對照。注射治療后第1、4、8周和第12

2、周，抽取關(guān)節(jié)腔滑膜液，采用雙抗體夾心ELISA法分析IL-1Ra、IL-1的表達。第12周后取實驗兔膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨和滑膜囊常規(guī)石蠟切片，HE染色和甲苯胺藍染色檢查病理改變，并進行大體標本評分和Mankin's關(guān)節(jié)軟骨病理組織學評分，評估pHSV-IL-1Ra-LacZ基因治療兔膝關(guān)節(jié)炎的效果。體外原代培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細胞，pHSV-IL-1Ra-LacZ轉(zhuǎn)染細胞，流式細胞儀檢測IL-1Ra過表達對關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡狀態(tài)。不同濃度的細胞

3、因子TNF-α(0ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、25 ng/mL)刺激IL-1Ra過表達的關(guān)節(jié)軟骨細胞，采用實時熒光定量PCR和Westernblot方法檢測TNF-α刺激IL-1Ra過表達恢復的作用機制。分別用對應的信號通路特異性抑制劑阻斷P38、ERK、JNK和PI3K信號通路(U0126，SB203580，SP600125，LY294002)，然后用熒光定量PCR和Western Blot檢測相關(guān)

4、炎癥因子的表達變化水平。
　　 結(jié)果：手術(shù)成功造模后，手術(shù)造模組注射pHSV-IL-1Ra-LacZ后能明顯持續(xù)抑制IL-1表達水平，且對膝關(guān)節(jié)軟骨炎進展顯著性抑制，大體評分結(jié)果顯示，手術(shù)造模pHSV-IL-1Ra-LacZ治療組較pHSV-LacZ治療組差異存在顯著性（2.21±1.05 vs3.95±0.32，P＜0.05），軟骨組織評分結(jié)果顯示pHSV-IL-1Ra-LacZ基因治療組與對照組組兔滑膜相比(2.08±0.8

5、7 vs3.89±0.12，P＜0.05)。但對滑膜炎無明顯治療作用。體外原代培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨細胞，利用基因重組技術(shù)獲得IL-1Ra過表達的細胞模型。在轉(zhuǎn)染pHSV-IL-1Ra-LacZ后，我們采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)IL-1Ra過表達促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡，較pHSV-LacZ存在顯著性差異(7.45±2.32 vs2.76±0.87，P＜0.05)。關(guān)節(jié)軟骨細胞加入不同濃度的TNF-α干預后，TNF-α能誘導關(guān)節(jié)軟骨細胞I

6、L-1Ra表達下調(diào)，以15 ng/mL濃度作用最為明顯。分別用對應的信號通路抑制物阻斷P38、ERK、JNK和PI3K信號通路后，同時進行TNF-α誘導和IL-1Ra過表達載體轉(zhuǎn)染，對照組加相同體積的DMSO，不進行信號通路阻斷，從結(jié)果可以看出，當用SB203580抑制P38通路后，IL-1、IL-6和IL-8等炎癥因子表達下降顯著，這說明IL-1Ra主要通過P38通路進行信號轉(zhuǎn)導而調(diào)控炎癥因子表達;用PD98059抑制ERK通路后，炎

7、癥因子表達下降也明顯，但不如P38通路，這說明IL-1Ra會部分參與ERK通路進行信號轉(zhuǎn)導;用JNK inhibitorⅡ抑制JNK通路后，炎癥因子表達也出現(xiàn)下降，不過差異不顯著，只是IL-8表達下降比較明顯，這說明IL-1Ra可能只是少部分參與JNK通路進行信號轉(zhuǎn)導;而當用LY294002抑制PI3K通路后，炎癥因子表達變化不明顯，可能IL-1Ra不參與PI3K通路進行信號轉(zhuǎn)導。
　　 結(jié)論：以單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型載體介導

8、IL-1Ra基因轉(zhuǎn)入兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腔內(nèi)，可獲得穩(wěn)定的外源IL-1Ra基因表達，可有效阻止OA的進一步發(fā)展，且具有時效性。因此，pHSV-IL-1Ra-LacZ單純皰疹病毒Ⅰ型載體關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎安全可行，IL-1Ra持續(xù)拮抗IL-1表達可能起重要的作用。IL-1Ra過表達促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡。IL-1Ra和細胞因子TNF-α刺激有拮抗作用。IL-1Ra主要通過P38通路進行信號轉(zhuǎn)導而拮抗IL-1、IL-6和IL-8等炎癥