重組人紅細胞生成素糖基化程度與生物學活性相關性.pdf

1、重組人紅細胞生成素(1lecombinant Human Erythropoietin，rHLIEPO)是一種高度糖基化的糖蛋白，其分子骨架為165個氨基酸組成的肽鏈，具3個N-連接的糖基化位點和1個O-連接的糖基化位點，其中糖基部分的重量約占40％。它在生物體內的活性不僅與其氨基酸序列有關，而且和蛋白質糖基化程度密切相關。影響rHuEPO生物學活性的主要部分是糖基上的唾液酸，唾液酸的含量不同使rHuEPO的活性不同，故HuEPO糖基化

2、程度的測定是質量控制的關鍵。實際工業(yè)化生產(chǎn)過程中，存在工程細胞株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝的差異，會導致rHuEPO蛋白的糖基化的不同，從而影響rHuEPO產(chǎn)品的質量。目前rHuEPO的產(chǎn)品質量控制主要根據(jù)體內效價的檢測結果，然而目前的rHuEPO體內檢驗方法有明顯的缺陷，周期較長，并且存在實驗動物的個體差異，實驗的重復性不太理想。 為此，利用檢測rHuEPO糖基化程度的幾種理化方法，對六批不同生產(chǎn)工藝的rHuEPO原液，分別采用Folin

3、-酚試劑法測定蛋白質的含量、利用間苯二酚顯色法測定總唾液酸含量、利用等電聚焦電泳測定等電點、利用毛細管區(qū)帶電泳檢測連接的多種寡糖形式以及定，性和定量分析各異構體的豐度、利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測免疫學活性、利用動物網(wǎng)織紅細胞計數(shù)實驗測定生物學活性。根據(jù)各檢測結果，利用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件分析其與生物學活性的相關性。結果發(fā)現(xiàn)唾液酸含量和生物學活性之間存在明顯的正相關，而免疫學活性與生物學活性之間有明顯的偏離，兩者不存在相

4、關性；等電點與生物活性存在一定相關性，利用毛細管區(qū)帶電泳檢出rHuEPO蛋白均有糖基化不同的八個異構體，研究發(fā)現(xiàn)各異構體的豐度不僅僅與生物學活性和唾液酸之比存在顯著的相關性，而且與免疫學活性和唾液酸之比存在顯著的相關性，在此基礎上又研究了兩者之間的回歸關系，建立主要影響因子與免疫學活性、生物學活性和唾液酸之比線性回歸函數(shù)模型。，從而直觀、準確的判斷rHuEPO的產(chǎn)品質量，為全面快速評價產(chǎn)品質量提供依據(jù)，為生產(chǎn)工藝的改進和提高提供指導依據(jù)