與sFlt-1相關的miR-10b和miR-200c在子癇前期發(fā)病中作用的研究.pdf

1、子癇前期(pre-eclampsia,PE)是一種嚴重的妊娠特有疾病,發(fā)病率約為10％,是妊娠期導致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。較早的研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血可溶性血管內(nèi)皮生長因子1(soluble fms-like tyrsine kinase-1,sFlt-1)表達異常增高,在子癇前期的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要的作用。目前關于sFlt-1導致子癇前期發(fā)病的機理,普遍認為在PE患者發(fā)病起始,由于某種原因導致患者胎盤sFlt-1表達異常

2、增高,致使患者胎盤血管重鑄障礙及全身毛細血管內(nèi)皮損傷。但是,導致sFlt-1表達異常增高的具體機制尚不清楚。
　　微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA,多項研究已經(jīng)證明其在基因調(diào)控方面起著重要的作用。近來的研究表明,某些miRNA在小鼠和人胎盤組織中表達異常升高,在PE患者胎盤中差異表達。越來越多的研究證實在PE患者胎盤中部分差異表達的miRNA在細胞粘附、免疫、信號傳導與細胞周期、心血管

3、的發(fā)育等等,這些在子癇前期發(fā)病中起著主要作用的通路上發(fā)揮著重要的作用。由此可見,miRNA與子癇前期的關系是一個全新的研究熱點。
　　在前期的實驗中,我們發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤中miR-10b及miR-200c存在差異表達,生物信息學軟件預測其異常表達可能與sFlt-1異常增高相關。因此有必要從miRNAs角度深入研究導致sFlt-1異常表達的具體機理,及其對sFlt-1生物學功能的影響,從而為研究子癇前期發(fā)病機理提供新的線索。

4、　　目的
　　1.檢驗miR-10b和miR-200c是否在PE胎盤組織中與正常胎盤存在差異表達,驗證其與sFlt-1是否具有相關性。
　　2.闡明miR-10b和miR-200c與sFlt-1的靶向調(diào)節(jié)關系。
　　3.研究 miR-10b對正常人滋養(yǎng)細胞系(HTR-8/SVneo))生物學功能的調(diào)控,進一步揭示其發(fā)病機理。
　　方法
　　1. ELISA檢測不同孕周孕婦外周血血清sFlt-1的表達以及孕晚

5、期PE患者與正常孕婦外周血 sFlt-1的差異表達;step-loop實時定量 PCR(Real-time PCR)的方法驗證PE組與正常孕婦組中miR-10b及miR-200c的表達;驗證miR-10b及miR-200c表達與sFlt-1差異及患者病情輕重是否存在相關性。
　　2.構建 sFlt-1表達質粒,熒光素酶報告基因技術驗證 miR-10b及 miR-200c與sFlt-1的靶向作用關系;過表達miR-10b后, Rea

6、l time PCR技術檢測在人正常滋養(yǎng)細胞系(HTR-8/SVneo)中miR-10b及sFlt-1 mRNA的表達;同時ELISA檢測sFlt-1的蛋白表達。
　　3.在人正常滋養(yǎng)細胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b,采用MTT、流式雙染細胞術、侵襲小室技術、三維細胞成型實驗,檢測抑制 miR-10b對于滋養(yǎng)細胞凋亡、增殖周期、浸潤以及血管內(nèi)皮成型功能等功能的影響。
　　結果
　　1. ELISA結果

7、顯示,在不同孕周孕婦外周血血清中sFlt-逐漸升高,s-PE患者外周血中sFlt-1明顯高于正常妊娠組(5795.7±629.11VS2144.2±406.16)(P<0.05)。step-loop實時定量PCR(Real-time PCR)結果顯示,PE患者胎盤組織中miR-10b的表達較正常孕婦組明顯降低(0.43±0.21 VS1.08±0.32)(P<0.05),而 PE患者中miR-200c的表達較正常孕婦組升高(5.26±0

8、.35VS1.07±0.03)(P<0.05)。miR-10b及200c差異表達與sFlt-1具有一定的相關性。
　　2.采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行靶點驗證,構建含有 sFlt-1全長3’UTR的GV126-sFlt-1-3’UTR報告基因質粒,分別含有針對結合種子區(qū)突變4個堿基的突變體GV126-sFlt-1-3’UTR-mut1(10b)和GV126-sFlt-1-3’UTR-mut2(200c)。結果證實,轉染miR-10

9、b mimcs與野生型載體的實驗組后熒光素酶活性下降40%,而突變體無明顯改變;轉染miR-200c mimcs與野生型載體的實驗組起熒光素酶活性無明顯改變。此外,在人正常滋養(yǎng)細胞系(HTR-8/SVneo)中抑制miR-10b,ELISA結果顯示,細胞培養(yǎng)液中sFlt-1增加42%。
　　3. MTT及流式雙染細胞術結果顯示,在人正常滋養(yǎng)細胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b表達,各實驗組與對照組在細胞周期、細胞增殖

10、及凋亡無明顯差異(P>0.05);但是侵襲實驗顯示;miR-10b對滋養(yǎng)細胞的浸潤有明顯的促進作用,兩者間存在明顯差異(41.25±7.8VS65.8±11.6)(P<0.05)。抑制表達miR-10b后滋養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液sFlt-1實驗組與對照組有明顯差異(310.5±20.4VS182.3±38.5)(p<0.05),對人血管內(nèi)皮細胞成型功能有抑制作用(2.43±0.28 VS6.32±0.32)(p<0.05)。
　　結論