小麥抗白粉病基因Pm6、Pm21、Pm23 RGAP標(biāo)記的鑒定.pdf

1、本研究中，結(jié)合小麥抗性鑒定結(jié)果，選擇河南省麥區(qū)具有良好抗病性，含不同抗白粉病基因的13個(gè)小麥品系，同時(shí)選感病品種Chancellor作為對照。根據(jù)抗病基因保守序列，合成7對RGA引物，進(jìn)行RGAP分析。 通過RGAP引物的篩選，發(fā)現(xiàn)引物R11R/R11F在含有Pm6基因的Timgalen中擴(kuò)增出1102bp的多態(tài)性片段C2，在感病品種Chancellor和含其它抗白粉病基因品系中則擴(kuò)增不出該片段。對該片段進(jìn)行克隆測序，DNA序列

2、分析發(fā)現(xiàn)，C2與Genbank中的小麥抗葉銹病基因Lr10(序列登錄號為AY270159.1)、小麥中的抗病基因類似序列RGA2(序列登錄號為AF326781.1)、小麥NBS-LRR類蛋白mRNA序列(序列登錄號為AY084050.1)，有較高的相似性。C2推定的蛋白質(zhì)保守區(qū)域分析，結(jié)果表明，C2的氨基酸序列包含抗病基因的類似序列，有1個(gè)不完整的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NB-ARC)和2個(gè)亮氨酸重復(fù)(LRR)保守結(jié)構(gòu)域。 進(jìn)一步對C2

3、做序列延伸，結(jié)果向5’端成功延伸852bp，與C2拼接后為1954bp。對拼接序列進(jìn)行Blast序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段相對于C2，與相應(yīng)序列相比DNA類似性升高。氨基酸序列保守區(qū)域分析結(jié)果表明，拼接序列的NB-ARC區(qū)域比C2延伸23個(gè)氨基酸，類似性由原來的27.9％提高到35.4％。并且與登錄號分別為AAW78913.1、AAK84082.1、AAQ01786.1、XP483560.1、BAA76281.2和ABA98920.1已知的抗

4、病蛋白序列有較高的類似性。 利用軟件GENSCAN1.0進(jìn)行基因預(yù)測分析，結(jié)果表明13-C2含有2個(gè)外顯子，編碼396個(gè)氨基酸，cDNA長1188bp。利用軟件Tmpred對13-C2編碼序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有2或3個(gè)跨膜螺旋。 在7對RGAP引物中只有R11R/R11F一對引物，能夠在攜帶Pm21基因的揚(yáng)麥5/sub6v中擴(kuò)增出1317bp的多態(tài)性片段，在感病品種Chancellor和其它抗白粉病基因載體品系中則擴(kuò)增不

5、出該片段，對該多態(tài)性片段回收、克隆、測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)C3第1-199核苷酸、第520-792核苷酸兩個(gè)區(qū)域，與Genbank中的已知序列有較高的類似性，這些序列中均含有抗性蛋白的保守區(qū)域。例如：與小麥抗葉銹病基因Lr10的序列(AY270159.1)比較結(jié)果顯示，有兩區(qū)域的類似性達(dá)89％和86％。發(fā)現(xiàn)C3的氨基酸序列包含抗病基因的類似序列，有1個(gè)不完整的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NB-ARC)。并與已知的抗性蛋白序列有一定的類似性

6、。 C3列向3’延伸長度為387bp，向5’延伸長度為1028bp，與C3拼接后長達(dá)2562bp。對拼接序列13-C3進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)其第20-699、824-1133、1451-1723、核苷酸三個(gè)區(qū)域，與Genbank中的已知序列Y14573.1、AF326781.1、AY270159.1、AY084050.1、AY663391.1、AY485643.1有較高的同源性。其中與小麥抗葉銹病基因Lr10序列(AY2701

7、59.1)，有兩個(gè)區(qū)域類似性分別達(dá)87％和89％。拼接序列13-C3的氨基酸保守區(qū)域分析結(jié)果表明，NB-ARC區(qū)域的5’端比C3延伸23個(gè)氨基酸，類似性由原來的21.3％提高到29.2％。并且與Genbank中含已知的抗病蛋白序列AAW78913.1、AAK84082.1和AAQ01786.1有較高的類似性 進(jìn)一步挑選26個(gè)純合的F2感抗單株初步驗(yàn)證其連鎖性，發(fā)現(xiàn)有較高的連鎖性。要想實(shí)現(xiàn)精確定位，需要擴(kuò)大作圖群體。 在7

8、對RGAP引物中只有3LR/3LF一對引物，能夠在攜帶Pm23基因的81-7241中擴(kuò)增出253bp的多態(tài)性片段，在感病品種Chancellor和其它抗白粉病基因載體品系中幾乎未出現(xiàn)該片段，對該多態(tài)性片段回收、克隆、測序結(jié)果進(jìn)行Blast類似性分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記3LR/3LF253與大麥Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(GenbankNo：AY040832.1和AY040833.1)的核心蛋白基因(group-specificantigen