PD-1-PD-L1信號通路對小鼠脊髓損傷修復的影響.pdf

1、由于血-脊髓屏障的存在，正常情況下免疫細胞無法與脊髓神經(jīng)組織接觸，從而使脊髓呈―免疫豁免‖狀態(tài)。然而脊髓損傷發(fā)生后，則打破這種―免疫豁免‖狀態(tài)。在脊髓損傷早期，脊髓固有免疫系統(tǒng)被激活，包括早期浸潤的單核細胞和活化的小膠質(zhì)細胞，形成巨噬/小膠質(zhì)細胞群。由于脊髓損傷造成的屏障系統(tǒng)的破壞，使得脊髓神經(jīng)系統(tǒng)抗原通過血液和淋巴到達淋巴器官；此外，浸潤到脊髓損傷區(qū)的巨噬/小膠質(zhì)細胞將抗原遞呈給淋巴細胞，激活針對脊髓神經(jīng)組織的適應性免疫反應。免疫系統(tǒng)

2、針對脊髓神經(jīng)組織形成特有的免疫炎癥反應，參與脊髓損傷后內(nèi)環(huán)境的構(gòu)成，影響脊髓損傷的預后。
　　PD-1/PD-L1是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的免疫負調(diào)控信號通路，通過調(diào)節(jié)淋巴細胞和巨噬細胞的活性參與機體免疫耐受。然而該信號通路是否參與脊髓損傷后的免疫炎癥反應的調(diào)節(jié)，目前依然是空白。因此本碩士研究課題通過建立PD-L1高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，以及PD-1基因敲除小鼠，對PD-1/PD-L1信號通路在脊髓損傷后的作用做了初步的探討。
　

3、　實驗共分兩部分：首先建立PD-L1高表達轉(zhuǎn)基因小鼠，并觀察其與野生型動物在脊髓損傷后運動功能恢復的情況；接下來的研究又觀察了PD-1基因敲除動物在脊髓損傷之后的情況，分別比較了其與野生型小鼠在脊髓損傷后運動功能恢復的情況，并且在運動功能恢復水平出現(xiàn)差異的時間點，進一步比較了兩種動物脊髓損傷區(qū)的面積和CD4+T淋巴細胞及巨噬/小膠質(zhì)細胞和其兩種亞群的浸潤情況。
　　我們成功的構(gòu)建了PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠，并且觀察到PD-L1轉(zhuǎn)基因小

4、鼠較野生型小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟的T、B淋巴細胞和外周組織內(nèi)均明顯高表達PD-L1分子，另外觀察到PD-L1轉(zhuǎn)基因動物與野生型動物的主要臟器尺寸和重量以及日常行為方式和野生型小鼠相比均無明顯差異。通過研究發(fā)現(xiàn)PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠在脊髓損傷后期運動功能恢復情況明顯好于野生型小鼠，而且在脊髓損傷21天后出現(xiàn)統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　在接下來的一部分實驗中，分別制作PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓夾傷的動物模型，并且利用B

5、BB評分量表評價兩種動物脊髓損傷后運動功能恢復情況，發(fā)現(xiàn)在7天、28天及以后的時間點兩種動物運動功能恢復水平出現(xiàn)差異，隨后進一步研究了PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠在脊髓損傷7天后CD4+T淋巴細胞的浸潤情況、損傷區(qū)面積和脊髓損傷區(qū)巨噬/小膠質(zhì)細胞浸潤的情況。通過分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-1基因敲除小鼠在脊髓損傷后其運動功能恢復情況在脊髓損傷初期較野生型小鼠恢復差（p<0.01），但隨著脊髓損傷時間的延長，PD-1基因敲除小鼠運動功能水平

6、逐漸和野生型小鼠相近，繼而在脊髓損傷后14天BBB得分超過野生型小鼠，并且在損傷28天后PD-1基因敲除小鼠運動功能明顯好于野生型小鼠，并出現(xiàn)統(tǒng)計學意義（p<0.05）。通過分析形態(tài)學的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷7天時PD-1基因敲除小鼠脊髓的損傷區(qū)范圍較野生型小鼠明顯縮?。≒<0.01），也在脊髓損傷早期就有CD4+T淋巴細胞浸潤到脊髓損傷區(qū)（p<0.05），還發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷早期浸潤的巨噬/小膠質(zhì)細胞也較野生型小鼠多，進一步發(fā)現(xiàn)在PD-1基因

7、敲除小鼠脊髓損傷區(qū)M2型巨噬/小膠質(zhì)細胞浸潤的數(shù)量多于野生型小鼠，但M1型巨噬/小膠質(zhì)細胞浸潤的情況則相反，表現(xiàn)出野生型小鼠脊髓損傷區(qū)浸潤大量的M1型巨噬/小膠質(zhì)細胞。綜合分析PD-1基因敲除小鼠、野生型小鼠和PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠BBB評分結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在運動功能恢復水平的平臺期，運動功能恢復水平從高到低依次為PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠、PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠。
　　我們初步發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號通路在小鼠脊髓損傷后對脊髓損