抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽雙功能分子的制備與鑒定.pdf

1、抗人紅細(xì)胞抗體是一類針對(duì)人紅細(xì)胞表面各種抗原的單克隆抗體。在抗人紅細(xì)胞單克隆抗體中，IgG類抗體因其在鹽水中能與紅細(xì)胞結(jié)合但不使紅細(xì)胞凝集，被稱為抗人紅細(xì)胞非凝集型單克隆抗體。近年研究證實(shí)，該類單克隆抗體無論是在疾病診斷還是臨床治療方面，都具有很大的潛力。目前，國(guó)內(nèi)外已制備了許多非凝集型抗人紅細(xì)胞單克隆抗體。實(shí)踐證明，將抗人紅細(xì)胞單克隆抗體改造成重組的單鏈抗體，將進(jìn)一步拓展該類單抗的應(yīng)用范圍。 H血型抗原是Hh血型系統(tǒng)中唯一的抗

2、原。除稀有的孟買(Bombay)型紅細(xì)胞外，H抗原分布在所有人紅細(xì)胞的表面。與紅細(xì)胞表面其他特有抗原相比，H抗原屬于共有抗原，在各型紅細(xì)胞中分布廣泛，應(yīng)用價(jià)值較大。根據(jù)自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)原理建立的抗原、抗體檢測(cè)方法是抗紅細(xì)胞抗體在免疫診斷方面的應(yīng)用之一。 自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的基本原理是：取一滴被檢者自身的全血，向其中加入一種雙功能分子，這種雙功能分子既可以結(jié)合全血中的紅細(xì)胞，又可與待檢的抗原或抗體結(jié)合，如果該血樣中含有待檢的抗體

3、或抗原，那么，雙功能分子將分別與紅細(xì)胞和待檢物結(jié)合，通過該雙功能分子的橋聯(lián)作用，將血中的紅細(xì)胞連接到一起，從宏觀上看，就會(huì)呈現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，即為自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。 本研究在已經(jīng)制備了一株分泌抗人紅細(xì)胞H抗原的雜交瘤細(xì)胞株2E8的基礎(chǔ)上，建立了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的自體全血凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)血液中是否有抗HIV-1 gp41抗體的存在。 1.抗體可變區(qū)基因的克隆 通過RT-PCR的方法，從分泌抗人紅細(xì)

4、胞H抗原的雜交瘤細(xì)胞株2E8中克隆了抗體重鏈可變區(qū)基因(V<,H>)和輕鏈可變區(qū)基因(V<,L>)，基因大小分別為351bp和339bp。其中，VH屬于鼠抗體可變區(qū)重鏈基因家族Ⅰ(B)亞群，V<,L>屬于鼠抗體可變區(qū)輕鏈基因家族Ⅰ亞群。 2.單鏈抗體蛋白的表達(dá)與鑒定 通過重疊引物延伸法(SOE)將克隆的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因拼接成抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因，基因大小為750bp。將序列鑒定正確的單鏈抗體基因用BamH

5、 Ⅰ和Nhe Ⅰ酶從中間載體上酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的pET-his載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-his-scFv。將含單鏈抗體基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plysS菌中，用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)單鏈抗體蛋白。采用SDS-PAGE、Western blottirng法鑒定單鏈抗體蛋白的表達(dá)，證實(shí)目的蛋白以包涵體的形式獲得了大量表達(dá)，其分子量大小約32kDa。經(jīng)ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、免疫熒光、凝集抑制等試驗(yàn)證實(shí)單

6、鏈抗體蛋白具有與紅細(xì)胞表面H抗原結(jié)合的活性。 3.抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽基因的表達(dá)與鑒定 在成功亞克隆單鏈抗體基因的基礎(chǔ)上，將2E8 C<,H>1基因和HIV-1gp41抗原肽基因順次連接到單鏈抗體基因的C端，亞克隆抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽基因，基因大小為1150bp。將序列正確的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽基因從中間載體上酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的pET-h

7、is載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-his-scFv-C<,H>1-gp41。 將構(gòu)建的含抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plysS菌中，用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)融合蛋白。采用SDS-PAGE、Western blotting法鑒定融合蛋白的表達(dá)，證實(shí)目的蛋白以包涵體的形式獲得了大量表達(dá)，其分子量大小約45kDa。經(jīng)ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、免疫熒光、凝集抑制等試驗(yàn)證

8、實(shí)融合蛋白具有與紅細(xì)胞表面H抗原結(jié)合的活性。 4.基于融合蛋白的全血免疫檢測(cè) 系統(tǒng)模擬檢測(cè)采用正常O型紅細(xì)胞、已經(jīng)確認(rèn)的含HIV-1gp41抗體血漿、上述表達(dá)產(chǎn)物等模擬全血免疫檢測(cè)系統(tǒng)。結(jié)果表明30份經(jīng)WB確證的陽性HIV血漿均可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，符合率為100％，其中強(qiáng)凝集樣本22份，弱凝集樣本8份。用A、B、AB三種血型紅細(xì)胞分別與6份經(jīng)WB確證的陽性HIV血漿組成全血與雙功能分子融合蛋白作用后，均產(chǎn)生了凝集反應(yīng)。