牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號通路和產(chǎn)生內(nèi)皮素-1-一氧化氮的研究.pdf

1、目的：分析兩種不同fimA型牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)炎癥反應(yīng)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及產(chǎn)生內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的影響。
　　 方法：1.厭氧培養(yǎng)ⅡfimA型(WCSP115)、Ⅳ

2、fimA型(W83)P.gingivalis，熱酚-水法提取P.gingivalis-LPS，SDS-PAGE、鱟試驗(yàn)對提取的LPS予以鑒定。2.體外培養(yǎng)HUVECs(CRL-2480)，待單層融合后，分別加入不同終濃度的Ⅱ、ⅣfimA型Pgingivalis-LPS(0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)共同培養(yǎng)2h、6h、24h，提取HUVECs總RNA，Real Time-PCR檢測CD14、TLR2(Toll-like

3、 receptor2)、TLR4(Toll-likereceptor4)和MyD88(myeloid differentiation factor88)、ECE-1的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測HUVECs膜表面CD14、跨膜受體TLR2和TLR4膜蛋白表達(dá)量，ELISA法檢測上清中ET-1的水平，硝酸還原酶法測定上清NO的水平。
　　 結(jié)果：1.Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs C

4、D14mRNA表達(dá)量增加，ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs CD14mRNA表達(dá)水平強(qiáng)于ⅣfimA型；2h時(shí)，ⅣfimA型和24h時(shí)，Ⅱ fimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)CD14mRNA相對表達(dá)量增加呈濃度依賴性。2h時(shí)，Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)CD14膜蛋白水平與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6h時(shí)，ⅡfimA型P.gingivalis-LPS5μg/ml、10μ

5、g/ml及ⅣfimA型5μg/ml，24h時(shí)，ⅡfimA型10μg/ml、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS5μg/ml、10μg/ml組誘導(dǎo)CD14膜蛋白水平高于陰性對照組(P<0.05)，與基因水平相符，6h時(shí)，0.5μg/ml組ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)CD14膜蛋白水平低于陰性對照組(P<0.05)，與基因表達(dá)水平不一致；6h、24h時(shí)，ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)CD14膜蛋

6、白水平升高呈濃度依賴性；ⅡfimA型10μg/ml、ⅣfimA型5μg/ml的P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)CD14膜蛋白水平升高呈時(shí)間依賴性。
　　 2.6h、24h時(shí)，ⅡfimA型及三個(gè)時(shí)間段ⅣfimA型的高濃度組(5μg/ml、10μg/ml)P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)TLR2mRNA水平高于陰性對照組(P<0.05)，6h、24h時(shí)，ⅡfimA型和2h、6h時(shí)，ⅣfimA型P.gingiv

7、alis-LPS刺激TLR2mRNA相對表達(dá)量增加存在濃度依賴性；6h、24h時(shí)，ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR2mRNA表達(dá)水平強(qiáng)于ⅣfimA型(P<0.05)。2h時(shí)，Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR2膜蛋白水平與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6h、24h時(shí)，5μg/ml、10μg/mlⅡfimA型及6h時(shí)，5μg/ml、24h時(shí)，5μg/ml、10μg/mlⅣfimA型P.gin

8、givalis-LPS誘導(dǎo)的TLR2膜蛋白水平升高(P<0.05)，與基因水平相符；Ⅱ fimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR2膜蛋白水平具濃度依賴性。
　　 3.ⅡfimA型及6h、24h時(shí)，ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECsTLR4mRNA的表達(dá)量高于陰性對照組(P<0.05)，2h時(shí)，Ⅳ fimA型LPS刺激TLR4mRNA未見明顯表達(dá)(P>0.05)；24h時(shí)，Ⅱ fimA型、6h

9、時(shí)，Ⅳ fimA型P.gingivalis-LPS刺激TLR4mRNA相對表達(dá)量增加呈濃度依賴性；ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECsTLR4mRNA表達(dá)水平強(qiáng)于Ⅳ fimA型(P<0.05)；Ⅳ fimA型P.gingivalis-LPS刺激TLR4mRNA表達(dá)量增加呈時(shí)間依賴性。2h時(shí)，Ⅱ、Ⅳ fimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR4膜蛋白水平與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6h時(shí)，10μg/

10、mlⅡfimA型和24h時(shí)，ⅣfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR4膜蛋白水平高于陰性對照組(P<0.05)，與基因水平相符；6h、24h時(shí)，Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs分泌TLR4膜蛋白水平升高呈濃度依賴性；5μg/ml、10μg/ml的ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激TLR4膜蛋白水平升高呈時(shí)間依賴性。
　　 4.Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-L

11、PS刺激HUVECs MyD88mRNA表達(dá)量高于陰性對照組(P<0.05)；且ⅡfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs MyD88mRNA表達(dá)水平強(qiáng)于ⅣfimA型(P<0.05)；24h時(shí)，ⅡfimA型和2h、6h時(shí)，ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激MyD88mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性。
　　 5.Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS均能刺激HUVECs致ECE-1mRNA相

12、對表達(dá)量高于陰性對照組(P<0.05)；2h、6h時(shí)，5μg/ml組ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs表達(dá)ECE-1mRNA的水平強(qiáng)于Ⅱ fimA型(P<0.05)，24h時(shí)，三個(gè)濃度的ⅡfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs表達(dá)ECE-1mRNA的水平強(qiáng)于ⅣfimA型；
　　 6.Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS三個(gè)時(shí)間段刺激下，HUVECs的ET-1的分泌量高于陰

13、性對照組(P<0.05)，且存在著時(shí)間依賴效應(yīng)，24h時(shí)，分泌水平達(dá)到高峰，2h、6h時(shí)，Ⅱ、Ⅳ fimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs分泌ET-1的量隨LPS濃度增加而減少。
　　 7.三個(gè)時(shí)間段的Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS刺激下，HUVECs的NO釋放量高于陰性對照組(P<0.05)，ⅡfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs的NO釋放量升高水平強(qiáng)于Ⅳ fimA型(

14、P<0.05)，且存在著濃度及時(shí)間依賴效應(yīng)，24h時(shí)達(dá)高峰。
　　 結(jié)論：P.gingivalis-LPS可能通過以TLR2為主的CD14-TLR2/TLR4系統(tǒng)進(jìn)行跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并借助MyD88依賴性途徑進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，參與不同fimA基因型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng)；Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis-LPS低濃度時(shí)(0.5ug/ml)能夠刺激HUVECs促進(jìn)ET-1分泌和NO釋放，