脂肪干細胞來源的外來體促進皮膚創(chuàng)傷愈合的研究.pdf

1、目的：
　　軟組織創(chuàng)傷的經久不愈和愈合后的瘢痕形成是臨床兩大難點，也是研究熱點。最新研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞來源的外來體（exosomes）在創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮積極作用。然而，脂肪干細胞（ASCs）來源的exosomes在皮膚創(chuàng)傷修復中的作用及機制尚不清楚。本研究探討ASCs來源的exosomes對皮膚創(chuàng)傷愈合的主要效應細胞－成纖維細胞的生物學性能的影響，為促進軟組織創(chuàng)傷愈合以及提高修復質量提供理論依據，也為臨床應用提供新思路。
　

2、　方法：
　?。?）構建小鼠背部和腹股溝相同大小創(chuàng)傷模型，比較有脂肪層的腹股溝創(chuàng)口和無脂肪層的背部創(chuàng)口愈合快慢，并且創(chuàng)口組織免疫熒光檢測exosomes標志蛋白CD63的表達情況；
　?。?）從人脂肪間充質干細胞培養(yǎng)液中提取出ASCs分泌的exosomes，采用透射電鏡，Nanosigtht，Western blot三種方法分別對其進行形態(tài)學，直徑分布，蛋白組學的鑒定；
　?。?）將用CM-DiI熒光染料標記過的exo

3、somes加入到成纖維細胞的培養(yǎng)液，24h后熒光顯微鏡下觀察exosomes是否進入到成纖維細胞里，參與調控成纖維細胞的生物學行為；
　?。?）用不同濃度的exosomes（0,25,50,100ug/ml）刺激成纖維細胞，利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測exosomes對成纖維細胞的遷移能力的影響，CCK-8法檢測對成纖維細胞增殖能力和RT-PCR法檢測對膠原合成的影響；
　?。?）構建小鼠背部創(chuàng)傷模型，將DIR熒

4、光染料標記的exosomes通過鼠尾靜脈注射到小鼠體內，活體成像儀檢測exosomes是否遷移到創(chuàng)口部位，參與創(chuàng)傷愈合過程；
　　（6）采用Masson染色評估創(chuàng)口總體膠原纖維的表達情況，免疫組化檢測創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達情況，RT-PCR檢測創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成情況，同時計算創(chuàng)口愈合率。
　　結果：
　　（1）發(fā)現(xiàn)含有脂肪組織的腹股溝部位創(chuàng)傷愈合更快，外來體標志蛋白CD63免疫熒光結果顯示在該部位細胞分泌了更

5、多的外來體，發(fā)現(xiàn)脂肪組織對創(chuàng)傷愈合的積極影響，這提示可能跟exosomes有關。
　?。?）通過透射電鏡的檢測顯示提取的粒子是圓形的囊泡樣結構并且呈現(xiàn)典型的“杯口狀”，粒子的直徑大小約85％集中分布在30-100nm之間。同時，利用NanoSight儀器動態(tài)的觀察了外來體（exosomes）的直徑大小，濃度的檢測，以及布朗運動軌跡和動態(tài)追蹤視頻截圖，結果表現(xiàn)出和透射電鏡相似的實驗結果。通過蛋白免疫印跡法顯示提取出的粒子高表達外來體

6、標志蛋白CD63和CD9。
　?。?）體外示蹤實驗顯示exosomes可以進入到成纖維細胞胞漿里，提示exosomes可以被成纖維細胞攝取。
　　（4）exosomes對成纖維細胞的遷移，增殖具有明顯的促進作用，且具有濃度依賴性；exosomes可以顯著上調成纖維細胞的Ⅰ、Ⅲ型膠原和彈性蛋白的表達，尤其是在50ug/ml這個濃度的作用最明顯。
　　（5）體內示蹤實驗發(fā)現(xiàn)exosomes可以遷移到創(chuàng)口周圍。
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