應(yīng)用復(fù)合MS-PCR法快速檢測線粒體DNA編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性的研究.pdf

1、目的：為提高線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)遺傳標(biāo)記的個(gè)人識別能力和非母排除能力，篩選線粒體DNA編碼區(qū)頻率較好的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism SNP)基因座，利用復(fù)合MS-PCR(multiplexed mutagenically separated PCR)技術(shù)、銀染分型，建立線粒體DNA編碼區(qū)10個(gè)SNP基因座復(fù)合擴(kuò)增分型系統(tǒng)，以期為法醫(yī)鑒定提供mtDNA

2、-SNP新的遺傳標(biāo)記和新的檢測手段，并探討其應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)調(diào)查160例中國成都無關(guān)漢族個(gè)體mtDNA編碼區(qū)10個(gè)SNP基因座等位基因頻率和單倍型分布情況，為群體遺傳學(xué)提供新的數(shù)據(jù)。 方法： 從線粒體DNA編碼區(qū)篩選多態(tài)性較好的10個(gè)SNP(T12705C，G8701A，A8584G，T10400C，T4883C，C10873T，A15301G，C14783T，A3010G，A5460G)基因座。針對每個(gè)SNP基因座分別設(shè)

3、計(jì)兩條片段相差3～4個(gè)堿基的等位基因特異性引物和一條公共引物，優(yōu)化擴(kuò)增條件，使10個(gè)SNP基因座同時(shí)在一管中擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯帶后分析樣本的基因型。應(yīng)用直接測序技術(shù)以T12705C、C10873T和A5460G基因座為例研究該方法檢測的準(zhǔn)確性。 結(jié)果： 本研究成功建立了10個(gè)mtDNA-SNP基因座復(fù)合擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯帶分型的方法；不同SNP基因座為長度不同的單一譜帶，其分型結(jié)果

4、與直接測序一致；用上述方法對成都漢族160名無關(guān)個(gè)體10個(gè)mtDNA-SNP基因座進(jìn)行了準(zhǔn)確分型，分型結(jié)果可靠，重復(fù)性好。10個(gè)mtDNA-SNP基因座C12705T、A8701G、G8584A、C10400T，T4883C、C10873T、A15301G、C14783T、A3010G、A5460G等位基因頻率分別為0.382/0.618、0.482/0.518、0.825/0.175、0.494/0.506、0.169/0.831、0

5、.513/ 0.487、0.538/0.462、0.506.0.494、0.163/0.837、0.09/0.91，共檢出18種單倍型，單倍型的基因多樣性為0.8617，偶合概率值為0.1437。 結(jié)論： 本研究通過自行設(shè)計(jì)的10套引物，成功的構(gòu)建了10個(gè)線粒體SNP基因座復(fù)合MS-PCR擴(kuò)增、銀染分型體系。為提高mtDNA-SNP基因座的個(gè)人識別能力和非母排除能力提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、有效的SNP分型新方法