p-Akt、survivin在乳腺癌中的表達及以此為靶向的乳腺癌放射治療增敏研究.pdf

1、乳腺癌作為一種全身性的疾病需要使用不同的干預手段進行綜合治療，包括使用手術治療、化學藥物治療、放射治療、生物治療、內分泌治療等。放射治療在乳腺癌患者的局部控制中發(fā)揮著關鍵性的作用，能降低腫瘤在乳腺、胸壁及腋窩的局部復發(fā)。同時，有局部復發(fā)高危因素的乳腺癌患者，放射治療也能提高總的生存率，降低復發(fā)率和死亡率。但乳腺癌產(chǎn)生對放射治療的抵抗耐受時，使得這一治療手段實施存在困難。對各種治療措施包括放射治療抵抗耐受的機制可能是通過在腫瘤細胞中活化磷

2、脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinosit01-3-kinase，P13K/Akt)和/，或上調survivin的表達。 本課題圍繞p-Akt和survivin在乳腺癌中的表達及放射治療后的變化情況，探討它們在乳腺癌放射治療抵抗耐受中的作用。并研究通過魚藤素同時阻斷Akt信號通路和抑制survivin的表達從而達到在體外和裸鼠移植瘤模型體內增強乳腺癌對放射治療的敏感性。為將來臨床應用此策略提高乳腺癌對放射治療的敏感

3、性提供實驗依據(jù)。 第一部分 p-Akt、survivin在乳腺癌組織中的表達與臨床意義 【目的】探討p-Akt、survivin在乳腺癌組織中的表達及其臨床病理學意義，用于指導乳腺癌的臨床治療。 【材料和方法】收集2006年6月-2 006年12月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺內分泌外科中心手術切除的68例女性乳腺癌患者標本，術前未接受放、化療和內分泌治療，均有組織病理學確診。10例正常乳腺組織標本作對照。采用SP

4、免疫組織化學方法檢測p-Akt、survivin、HER2、ER、PR、p53的表達，并分析p-Akt、survivin與其它各指標的關系。 【結果】正常乳腺組織病理標本10例，乳腺癌組織病理標本68例。其中浸潤性導管癌58例，導管內癌8例，小葉癌2例。病理分期(pTNM)：I期16例，Ⅱ期35，Ⅲ-Ⅳ期17例。運用免疫組織化學SP法檢測p-Akt、survivin陽性表+達細胞均為細胞胞漿和/或胞核著色。有關生物學指標的陽性表

5、達率為：p-Akt 41.2％(28/68)；survivin 51.5％(35/68)；HER2 33.8％(23/68)；ER 58.8％(40/68)；PR 57.4％(39/68)；p53 55.9％(38/68)。正常乳腺組織中p-Akt、survivin均無表達。進一步分析顯示，p-Akt、survivin的表達與HER2的表達呈正相關(r值分別為0.412，0.383；P值分別為0.001，0.001)；與PR的表達呈負相

6、關(r值為-0.306；P值為0.011)。p-Akt陽性表達與患者年齡無關，但與腫瘤病理分期、淋巴結轉移狀況和腫瘤大小相關。survivin的陽性表達與患者年齡、腫瘤病理分期和腫瘤大小無關，但與淋巴結轉移狀況相關. 【結論】p-Akt和survivin在乳腺癌組織中的活化和高表達與腫瘤的發(fā)展顯著相關，是乳腺癌患者預后不良的判斷指標之一。p-Akt和survivin可以作為乳腺癌抗腫瘤治療的新靶標。 第二部分放射治療對乳

7、腺癌細胞中p-Akt和survivin表達的影響及魚藤素增強乳腺癌細胞放射治療敏感性的研究 【目的】探討p-Akt和survivin在乳腺癌放射治療抵抗耐受及以此為靶標魚藤素放射治療增敏中的作用，為未來的臨床研究尋找有用的分子標記物。 【材料和方法】使用Y射線照射或魚藤素及兩者聯(lián)合處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞。采用MTT比色法進行細胞生長抑制實驗；用Westernblot方法檢測Akt、phospho-Ser47

8、3-Akt、survivin、cleaved caspase-3蛋白的表達情況；流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡情況；克隆源細胞檢測測定細胞存活分數(shù)。 【結果】魚藤素對于MDA-MB-231細胞生長抑制作用具有時效和量效關系。不同劑量的Y射線照射對于MDA-MB-231細胞生長抑制率不同，3Gy的Y射線照射48h抑制率為(38±4)％，4Gy的Y射線照射抑制率為(56±7)％。Y射線照射與魚藤素聯(lián)合使用的細胞生長抑制率明顯高于Y

9、射線照射單獨使用的細胞生長抑制率(P<0.01)。3Gy的Y射線與10nmol/L魚藤素聯(lián)合對細胞生長抑制有協(xié)同效應。10nmol/L魚藤素能明顯地抑制MDA-MB-231細胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表達，增加cleaved caspase-3蛋白水平。3Gy的Y射線能誘導MDA-MB-231細胞磷酸化Akt、cleaved caspase-3蛋白水平上調，對survivin蛋白的表達無影響。而聯(lián)合使用能進一步抑制MDA-M

10、B-231細胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表達水平(P<0.01)， cleaved easpase-3蛋白表達水平增加(P<0.001)。10nmol/L魚藤素與3Gy的Y射線聯(lián)合處理MDA-MB-231細胞周期阻滯于G2/M期，細胞凋亡百分率明顯增加(P<0.01)。10nmol/L魚藤素能增強乳腺癌細胞對Y射線處理的敏感性，降低克隆源性細胞的生存。 【結論】魚藤素能減弱放射線對MDA-MB-231細胞促生存信號通路

11、Akt磷酸化的誘導激活，增強乳腺癌細胞對放射治療的敏感性。其作用機理主要是通過抑制細胞磷酸化Akt和survivin的表達，增加caspase依賴的細胞凋亡，阻滯細胞周期于G2/M期。 第三部分魚藤素同時阻斷Akt信號通路和抑制survivin的表達對乳腺癌裸鼠移植瘤模型放射治療增敏的研究 【目的】研究魚藤素對乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治療作用，以及與放射治療聯(lián)合使用的放射增敏效果，為今后臨床研究提供實驗依據(jù)。 【材

12、料和方法】動物：BALB/c雌性裸鼠，4-5周齡，體重18±2g/只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，共30只。接種MDA-MB-231人乳腺癌細胞成瘤后20天左右，腫瘤體積為100-140mm3時24只平均分成4組：對照組(C組)、deguelin組(D組)、放射治療組(RT組)、deguelin+放射治療組(D+RT組)。處理的方法及劑量：C組玉米油溶劑80μl/只/次，每日1次灌胃，每周5次；D組deguelin4mg/kg(

13、80μl)每日1次灌胃，每周5次：RT組用20y60Co照射，每日1次，每周5次；D+RT組給予deguelin和2Gy 60Co處理，劑量和方法同上.連續(xù)處理6周，每周稱量裸鼠體重并用電子游標卡尺測量腫瘤大小。使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3)=長(mm)×寬2(mm2)×π/6。處理結束后的第二周處死裸鼠，切取腫瘤，記錄裸鼠體重、腫瘤體積和重量，計算抑瘤率；同時切取部分腫瘤組織作流式細胞和westernblot檢查。

14、 【結果】各組裸鼠體重和移植生長腫瘤的體積在處理前具有均衡可比性。連續(xù)處理6周，腫瘤生長體積曲線顯示C組腫瘤生長最快，RT組次之，D組腫瘤生長較慢，而D+RT組腫瘤生長有縮小的趨勢。處理結束后腫瘤的平均體積(mm3)為：C組728.8±182.7，RT組427.8±106.4，D組260.8±68.4，D+RT組95.5 ±18.7。平均腫瘤重量(g)為：C組1.28±0.21，RT組0.68±0.14，D組0.42±0.06，D+R

15、T組0.25±0.05。平均抑瘤率為：RT組46.88％±10.95％，D組67.19％±5.01％，D+RT組80.60％±3.68％。各處理組之間及處理組與對照組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.000)。 流式細胞儀檢測表明與對照組相比，RT組對細胞周期的影響和D組相似，都可使Gl期和GJM期細胞比例增加，S期細胞比例減少，細胞凋亡率增加。但RT組作用無D組強。D+RT組的影響最大。各處理組與對照組之間比較差異均有統(tǒng)計學

16、意義(P<0.01)。 Western blot 檢測果表明，RT組的p-Akt、survivin的表達水平均增加，與其它組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。p-Akt和survivin的表達水平在D組衣D+RT組均是降低的，D+RT組下降更為明顯(P<0.004)。cleaved caspase-3的表達在各組均是增加的，以D+RT組增加最為明顯(P<0.001)。 【結論】放射治療能上調乳腺癌組織p-Akt和su