玉米DNA誘導(dǎo)的水稻變異株WGS及RNa-seq分析.pdf

1、外源DNA直接誘導(dǎo)水稻種胚細(xì)胞產(chǎn)生變異是分子育種的一個(gè)新途徑，是創(chuàng)制水稻新材料新種質(zhì)的便捷方法。利用基因組重測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法來(lái)研究外源DNA直接誘導(dǎo)水稻種胚細(xì)胞產(chǎn)生變異的分子機(jī)理，旨在探討外源DNA如何對(duì)受體基因組產(chǎn)生作用及受體基因組的變異情況，揭示變異的內(nèi)在規(guī)律，為外源DNA種胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)提供理論依據(jù)，為水稻分子標(biāo)記輔助育種、新的功能基因發(fā)現(xiàn)等提供理論數(shù)據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)室利用種胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化法（種胚細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)），將玉米基因

2、組DNA直接誘導(dǎo)受體水稻（日本晴）種胚細(xì)胞，獲得了在株高、分蘗數(shù)、分蘗性狀、穗型、根系等遺傳性狀上與對(duì)照相比有明顯變化的變異株RMIM92。
　　本研究首先采用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)變異株RMIM92進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明:
　　1、在變異株RMIM92基因組中共檢測(cè)到了258條玉米DNA片段，長(zhǎng)度在16bp-205bp之間。
　　2、玉米片段插入到受體水稻基因組中的位置是隨機(jī)的，整合到水稻基因組時(shí)多數(shù)是替換掉了不同長(zhǎng)

3、度的水稻序列。
　　3、插入玉米片段的103個(gè)水稻基因中，有43個(gè)基因僅發(fā)生錯(cuò)義突變、3個(gè)基因僅發(fā)生剪切位點(diǎn)突變，33個(gè)基因發(fā)生錯(cuò)義突變和剪切位點(diǎn)突變，12個(gè)基因發(fā)生錯(cuò)義突變和移碼突變，1個(gè)基因發(fā)生剪切位點(diǎn)突變和移碼突變，6個(gè)基因同時(shí)發(fā)生錯(cuò)義突變、剪切位點(diǎn)突變和移碼突變。
　　4、分析玉米序列插入（替換）位點(diǎn)臨側(cè)的水稻堿基發(fā)現(xiàn):AnA&AnA發(fā)生的頻率最高(10.4％)，CnG&GnC發(fā)生的頻率最低(3.1％)，這說(shuō)明:玉米

4、序列在堿基AA之間易插入，在堿基CG之間不易插入。
　　5、SNP突變類(lèi)型分析發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率(52.69％)大于顛換發(fā)生的頻率(47.31％)。
　　6、分析四種堿基發(fā)生突變的頻率，發(fā)現(xiàn):C(26.84％)＞G(26.73％)＞A(23.58％)＞T(22.84％)，表明堿基C、G發(fā)生突變的頻率較高，而A、T發(fā)生突變的頻率相對(duì)較低。
　　7、對(duì)突變堿基的臨側(cè)堿基統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):ANG(8.20％)＞ANC(7.64％)

5、＞ANT(7.49％)＞GNC(7.15％)＞CNT(6.73％)＞ANA(6.62％)＞TNT(6.36％)＞TNC(6.21％)＞CNA(6.17％)＞GNT(5.91％)＞CNC(5.72％)＞CNG(5.68％)＞GNA(5.64％)＞GNG(5.04％)＞TNA(4.82％)＞TNG(4.63％)，表明A和G之間的堿基N發(fā)生突變的頻率最高，T和G之間的堿基N發(fā)生突變的頻率最低。
　　8、分析突變堿基的連續(xù)性發(fā)現(xiàn):單堿基突

6、變(94.12％)＞連續(xù)雙堿基突變(5.49％)＞連續(xù)三堿基突變(0.28％)＞連續(xù)多堿基突變(0.10％)，說(shuō)明堿基突變以單堿基突變?yōu)橹鳌?br>　　插入玉米序列的103個(gè)水稻基因在變異株RMIM92揚(yáng)花期劍葉和莖節(jié)中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明:
　　1、在變異株的劍葉和莖節(jié)中mRNA表達(dá)均上調(diào)的基因有16個(gè)，其中，在劍葉中上調(diào)幅度最高的是OS01G0115750，與CK1相比上調(diào)5.6倍;在莖節(jié)中上調(diào)幅度最高的是OS06G056840

7、0，與CK1相比，上調(diào)9.2倍。
　　2、在變異株的劍葉和莖節(jié)中mRNA表達(dá)均下調(diào)的基因有12個(gè)，其中，在劍葉中下調(diào)幅度最大的基因是OS01G0123900，與CK1相比，下調(diào)3.1倍;在莖節(jié)中下調(diào)幅度最大的基因是OS04G0344100，與CK1相比，下調(diào)了10.3倍。
　　3、與CK1相比，在劍葉中表達(dá)在莖節(jié)中不表達(dá)的基因有1個(gè)OS01G0124000，在莖節(jié)中均表達(dá)在劍葉中均不表達(dá)的基因有2個(gè)，分別是OS01G0152

8、500和OS04G0344100。
　　4、與CK1相比，在劍葉和莖節(jié)中均未表達(dá)的基因共有3個(gè)，分別是OS02G0614966、OS04G0165200和OS12G0554000。
　　5、與CK1相比，在劍葉中均表達(dá)上調(diào)在莖節(jié)中均表達(dá)下調(diào)的基因共有8個(gè)。
　　6、與CK1相比，在莖節(jié)中均表達(dá)上調(diào)在劍葉中均表達(dá)下調(diào)的基因共有5個(gè)。上述1-6的結(jié)果表明，外源DNA插入水稻基因組中直接影響了水稻基因的mRNA表達(dá)，影響的幾

9、種情況包括:基因過(guò)表達(dá)、基因表達(dá)水平降低、基因沉默和激活沉默的基因。
　　7、為進(jìn)一步分析變異株與表型之間的關(guān)系，對(duì)發(fā)生有義突變的目前已知功能基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明:與CK1相比，控制株高、穗粒數(shù)、抽穗期多效基因OS07G026120、控制粒寬粒重主效基因OS02G0244100、控制分蘗角度基因OS06G0704300在劍葉和莖節(jié)中均表達(dá)上調(diào);控制粒長(zhǎng)粒重基因OS03G0407400、控制分蘗角度基因OS09G05293

10、00在劍葉和莖節(jié)中均表達(dá)下調(diào);矮稈基因OS05G0333200、矮化少分蘗基因OS06G0127800在劍葉中均表達(dá)上調(diào)，在莖節(jié)中均表達(dá)下調(diào);控制株高、分蘗、小穗育性基因OS01 G0751600、控制葉片直立和矮化基因OS03G0227700在劍葉中均表達(dá)下調(diào)，在莖節(jié)中均表達(dá)上調(diào)。已知功能基因突變及表達(dá)水平的改變可能與變異株相對(duì)應(yīng)的表型變化有關(guān)。
　　總之，種胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是一種有效的生物誘變技術(shù)，既可以使外源DNA片段插入到受體