KH902玻璃體腔注射液配方的初步篩選試驗(yàn).pdf

1、第1部分KH902的溶劑免眼玻璃體腔注射的初步篩選試驗(yàn) 1．目的 脈絡(luò)膜新生血管造成進(jìn)行性、不可逆的中心視力喪失，目前尚無理想的治療方法。近來研究發(fā)現(xiàn)促血管生長因子水平上調(diào)在眼部新生血管子之一。因此，目前研究熱點(diǎn)集中在抗VEGF的治療上。KH902是一種通過玻璃體腔注射給藥的新型抗VEGF制劑。本實(shí)驗(yàn)觀察KH902的6種不同備選溶劑玻璃體腔注射后可能存在的眼部毒性作用，以篩選最佳的溶劑方案。 2．方法 2

2、．1 15只普通級(jí)健康新西蘭白兔，隨機(jī)分為7個(gè)組。注藥前裂隙燈顯微鏡及+120D前置鏡檢查眼前節(jié)及眼底，測(cè)定眼壓，行ERGs檢查。0組設(shè)為對(duì)照組，其余6組玻璃體腔注射等容積的溶劑：溶劑1組為histidine+9％trehalose+0.05％Tween-20；溶劑2組為succinate+9％trehalose+0.05％Tween-20；溶劑3組為PB+0．05％Tween-20；溶劑4組為succinate+9％trehalose

3、+0.05％Tween-20+6％甘露醇；溶劑5組為succinate+9％trehalose+0.05％Tween-20+0.6％甘露醇；溶劑6組為PBS。 2．2 注藥后24h、48h、1周、2周觀察眼內(nèi)炎癥反應(yīng)情況、玻璃體及視網(wǎng)膜情況。 2．3 注藥后2h、4h、8h、24h分別檢測(cè)其眼壓變化情況。 2．4 注藥后2周行視網(wǎng)膜電圖(ERGs)檢查，測(cè)最大混合反應(yīng)，記錄a波及b波振幅。 2．5 注藥后

4、20天摘除動(dòng)物眼球，以多聚甲醛固定，包埋切片后常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)，并在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。 2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析每組注藥前后及同期實(shí)驗(yàn)眼眼壓、a波及b波振幅、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異。 3．結(jié)果 3．1 溶劑3、5組各1眼及溶劑6組2眼出現(xiàn)了較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。溶劑4組中有1眼出現(xiàn)玻璃體混濁。 3．2 溶劑1組1眼、溶劑2組3眼、溶劑4組2眼、溶劑5

5、組1眼、溶劑6組2眼出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁。 3．3 溶劑1組和4組分別有1眼出現(xiàn)視網(wǎng)膜點(diǎn)狀出血。 3．4 溶劑1組注射后2h與注射前相比眼壓明顯降低。溶劑4組注射后8h與注射前相比眼壓明顯升高。溶劑5組注射后2h、24h眼壓明顯降低。 3．5 溶劑1組及4組HE染色光鏡觀察，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，內(nèi)、外核層水腫明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞明顯減少。溶劑1、2、3、4、5組的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞計(jì)數(shù)均減少，與對(duì)照組的差異均

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．6 根據(jù)上述結(jié)果分析，在本實(shí)驗(yàn)中，溶劑1刺激反應(yīng)較輕，對(duì)眼壓無明顯影響，可疑晶狀體毒性，但需排除操作因素，可疑視網(wǎng)膜毒性。溶劑2刺激反應(yīng)較輕，可能一過性升高眼壓，可疑晶狀體毒性，未見明顯視網(wǎng)膜毒性。溶劑3刺激反應(yīng)較輕，對(duì)眼壓無明顯影響，未見明顯晶狀體、視網(wǎng)膜毒性。溶劑4刺激反應(yīng)較輕，對(duì)眼壓無明顯影響，可疑晶狀體毒性，可疑視網(wǎng)膜毒性。溶劑5刺激反應(yīng)較重，可能降低眼壓，可疑晶狀體毒性，但需排除操作

7、因素，未見明顯視網(wǎng)膜毒性。溶劑6刺激反應(yīng)較重，對(duì)眼壓無明顯影響，可疑晶狀體毒性，未見明顯視網(wǎng)膜毒性。 4．結(jié)論 在備選溶劑中溶劑3(PB+0.05％Tween-20)毒性作用最小，最適合作為KH902的溶劑。 第2部分 KH902制劑猴眼玻璃體腔注射的初步篩選試驗(yàn) 1．目的 國內(nèi)外已有大量基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)證明抗VEGF制劑治療CNV的有效性。目前國外已有治療CNV的抗VEGF藥物上市，而國內(nèi)尚處

8、于研究階段。KH902是重組人血管內(nèi)皮生長因子受體．抗體融合蛋白注射液。 本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)比3種不同溶劑配制的KH902玻璃體腔注射液的安全性，以確定最佳的制劑方案。 2．方法 2．1 8只普通級(jí)恒河猴隨機(jī)分為4組，玻璃體腔注射前進(jìn)行眼壓測(cè)量、眼前節(jié)、眼底及ERGs檢查。對(duì)照組注射生理鹽水，其余3組為KH902制劑1組注射KH902制劑1，KH902制劑2組注射KH902制劑2，KH902制劑3組注射KH902制劑3

9、。 2．2 注藥后24h、48h、72h觀察眼內(nèi)炎癥反應(yīng)、玻璃體及視網(wǎng)膜情況。 2．3 注藥后0.5h、24h、48h分別檢測(cè)其眼壓變化情況。 2．4 注藥后5天行視網(wǎng)膜電圖(ERGs)檢查，記錄a波及b波振幅。 2．5 注藥后20天處死動(dòng)物，即刻摘除眼球，固定液固定眼球，包埋切片后常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察眼部結(jié)構(gòu)。 2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析每組注藥前后及同期實(shí)驗(yàn)眼眼壓、a波及b波振幅。

10、 3．結(jié)果 3．1 KH902制劑1組中2眼注射后第1天出現(xiàn)眼前房滲出物，阿托品眼膏點(diǎn)眼后前房滲出消失，注射后5天裂隙燈顯微鏡下可見有輕度玻璃體細(xì)胞(+～++)，KH902制劑3組中1眼注射后出現(xiàn)前房滲出，未予處理自愈。 3．2 眼底檢查：各組動(dòng)物注藥后各時(shí)間點(diǎn)眼底未見異常。 3. 3 注藥后0.5h、24h及48h眼壓與給藥前比較，各組未見顯著性差異。 3．4 ERGs：KH902制劑1組可見給藥后混合

11、反應(yīng)及視錐細(xì)胞振幅較給藥前降低。對(duì)照組及其余兩注射組注藥前后ERGs無明顯改變。 3．5 組織學(xué)檢查KH902制劑1組和．KH902制劑2組發(fā)現(xiàn)有前部葡萄膜炎(3眼)，KH902制劑2組發(fā)生視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層血管周圍炎(2眼)，KH902制劑2組有結(jié)膜慢性炎癥(2眼)，KH902制劑3組眼球未見明顯異常。 結(jié)論 KH902制劑1組和KH902制劑2組發(fā)現(xiàn)有輕度眼內(nèi)炎癥的病理學(xué)改變。KH902制劑1組注藥后ERGs混