可溶性PD-1和PD-L1分子對PD-1-PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其生物學意義.pdf

1、協(xié)同刺激信號在T細胞參與免疫應(yīng)答的起始、效應(yīng)和終止等不同階段都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用且需要達到相對平衡。PD-1/PD-L途徑介導的負性信號能有效抑制T、B細胞功能，在機體免疫應(yīng)答后期的負性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并在腫瘤免疫、自身免疫、移植免疫和慢性病毒感染等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學意義。
　　 PD-1(CD279)為負性協(xié)同刺激分子受體，其最顯著的特征是胞漿區(qū)含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和一個免疫受

2、體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)。PD-1主要在活化的T、B和NK等細胞上呈誘導性表達，PD-1有PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)兩個配體。PD-L1和PD-L2同屬B7超家族，在蛋白結(jié)構(gòu)上均包含有IgV樣區(qū)、IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和一個短而保守的胞漿區(qū)。PD-L1廣泛組成性表達于多種實質(zhì)器官組織、免疫細胞以及多種類型的腫瘤細胞上，而PD-L2僅表達于活化的巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓來源的基質(zhì)細胞和個別

3、腫瘤細胞株。研究表明，PD-1隨T細胞活化程度逐步上調(diào)表達，PD-1/PD-L相互作用后觸發(fā)ITSM基序募集信號分子SHP-2，引發(fā)抑制信號的產(chǎn)生，致使效應(yīng)性T細胞失能并及時進入凋亡。因此，PD-1/PD-L途徑對T細胞在免疫應(yīng)答過程中恰當而有效的調(diào)節(jié)具有重要的生物學意義，通過研究PD-1/PD-L與多種臨床疾病的相關(guān)性，闡明其作用機理，有望為這些疾病的免疫治療提供新策略。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，多種協(xié)同刺激分子能分別以細胞膜型和可溶

4、性兩種形式存在，包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等。可溶性分子可以通過蛋白水解酶裂解細胞上的膜型分子而形成，也可由專一的mRNA直接編碼產(chǎn)生。有些可溶性分子具有臨床診斷價值。
　　 本研究旨在構(gòu)建基因轉(zhuǎn)染細胞L929/PD-1和L929/PD-L1的基礎(chǔ)上，進一步研制鼠抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體，并對單抗的生物學特性進行研究；分別建立特異性檢測人sPD-1和sPD-L1的

5、ELISA方法，并對ELISA檢測體系的穩(wěn)定性和精確性等進行分析、評價；利用sPD-I的ELISA方法對健康人和自身免疫病患者外周血中的sPD-1表達水平及特性進行分析，同時，對sPD-1的產(chǎn)生機制進行研究，探討該可溶性因子對PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其在自身免疫病中的生物學意義；應(yīng)用建立的ELISA分析sPD-LI在人外周血和多種體外培養(yǎng)細胞上清中的表達特性，研究功能性sPD-L1的產(chǎn)生機制及其對T細胞的協(xié)同刺激效應(yīng)，分析肺

6、癌患者外周sPD-L1的表達及其與腫瘤細胞免疫逃逸的相關(guān)性。這些研究結(jié)果為闡明sPD-1和sPD-L1對PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其生物學意義提供了新的線索。
　　 一、鼠抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體的研制及生物學特性的研究
　　 [目的]研制特異性鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體，為研究人PD-1/PD-L1分子在免疫細胞上的表達特性和探討該抑制途徑對人免疫細胞的生物學效應(yīng)提供必要的物質(zhì)材料。

7、>　　 [方法]以穩(wěn)定高表達人PD-1、PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞L929/PD-1、和L929/PD-L1為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)進行細胞融合，并以基因轉(zhuǎn)染細胞和融合蛋白通過流式細胞術(shù)或ELISA方法篩選雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，將鑒定后符合要求的雜交瘤細胞株進行反復篩選和多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得多株分泌特異性鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用Ig亞型快速定性試紙法、單抗/單抗或

8、單抗/蛋白競爭結(jié)合抑制實驗、Westernblot和ELISA等試驗，對獲得的單克隆抗體進行生物學特性的鑒定；用間接免疫熒光法分析PD-1、PD-L1在不同類型細胞表面的表達特性；應(yīng)用獲得的單抗對人T、DCs等細胞進行體外生物學功能的研究。
　　 [結(jié)論]成功菝得多株新的鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體，識別不同抗原表位的單抗為進一步應(yīng)用于研制ELISA試劑盒，從而用于測定可溶性蛋白因子奠定了良好基礎(chǔ)。上述單抗的研制也為揭示

9、膜型PD-1和PD-L1的表達特性，探討PD-1/PD-L1抑制途徑對免疫細胞的調(diào)節(jié)作用及其生物學意義提供了必要的物質(zhì)材料。
　　 二、特異性檢測人可溶性PD-1、PD-L1蛋白ELISA試劑盒的研制
　　 [目的]研制特異性高靈敏度檢測人sPD-1和sPD-L1的ELISA試劑盒，為定量分析不同來源的臨床標本和研究這兩種可溶性因子的功能提供有效的檢測手段。
　　 [方法]利用anti-PD-1mAb(489)作

10、包被抗體在碳酸鹽緩沖液中預包被ELISA板，biotin-anti-PD-1mAb(9H1)作為檢測抗體識別與489相結(jié)合的抗原，再與Streptavidin-HRP反應(yīng)，最后用TMB底物進行顯色反應(yīng)，建立雙抗體夾心sPD-1酶聯(lián)檢測試劑盒。利用相同批次多組檢測孔進行精確性分析，利用相同批次ELISA板在不同測定時間點的準確性進行試劑盒穩(wěn)定性分析。同樣的方案，用anti-PD-L1mAb(2Hll)作為包被抗體和biotin-anti-

11、PD-L1mAb(10D7)作為檢測抗體建立特異性檢測人sPD-L1的ELISA體系。
　　 [結(jié)論]特異性高靈敏度檢測人sPD-1和sPD-L1ELISA試劑盒的建立為定量分析PD-1/PD-L1抑制途徑中可溶性蛋白因子提供了有效的檢測手段。
　　 三、sPD-1表達的特性及其對PD-1/PD-L1途徑的阻斷作用和在自身免疫病理中的意義
　　 [目的]揭示健康人外周血中sPD-1表達的特性，闡明機體中sPD-1

12、的產(chǎn)生機制，探討sPD-1在自身免疫病患者外周異常表達的意義及其對PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用。
　　 [方法]利用自主研制的sPD-1ELISA試劑盒檢測分析不同年齡段健康人外周血中sPD-1的表達求平；流式細胞術(shù)和ELISA分析人T細胞在體外刺激活化過程中膜型和可溶性PD-1的表達特性；通過RT-PCR和TP-PCR法克隆人全長PD-1(flPD-1)、缺失外顯子3的PD-1(PD-1Aex3)和PD-1胞外段(sPD

13、-1)基因，構(gòu)建plRES2-EGFP/flPD-1、plRES2-EGFP/PD-1Aex3和plRES2-EGFP/sPD-l重組真核表達載體，用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，于不同時間點收集基因轉(zhuǎn)染細胞并用免疫熒光標記技術(shù)分析細胞膜上PD-1的表達，用Westernblot和sPD-1ELISA方法對各轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中sPD-1進行定性和定量分析；合成PD-1蛋白胞內(nèi)段特定的抗原肽，免疫新西蘭兔制備兔抗人PD-1胞內(nèi)段多抗；免疫

14、沉淀技術(shù)收集人血清中的sPD-1并進行Westernblot，應(yīng)用兔抗人PD-1胞內(nèi)段多抗與sPD-1蛋白雜交顯色，進而鑒定sPD-1蛋白特性；通過競爭抑制實驗分析sPD-1蛋白與PD-L1、PD-L2的結(jié)合能力；利用sPD-1ELISA和Westernblot方法對自身免疫病患者（Graves’、RA和HSP）外周血中該因子進行定量和定性分析。
　　 [結(jié)論]功能性sPD-1存在并高表達于自身免疫病患者外周為進一步闡明sPD-

15、1對PD-1/PD-L1抑制信號的阻斷作用開拓了新的途徑，為探討該可溶性因子在生理和自身免疫病理條件下的生物學意義奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 四、sPD-L1表達的特性及其對PD-1/PD-L1途徑促進作用和在腫瘤免疫逃逸中的意義
　　 [目的]應(yīng)用sPD-L1ELISA揭示健康人外周血和多種體外培養(yǎng)細胞上清中sPD-L1表達的水平和特性，闡明sPD-L1的產(chǎn)生機制，探討sPD-L1在腫瘤患者外周異常表達的意義及其對PD-

16、1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用。
　　 [方法]利用自主研制的sPD-L1ELISA試劑盒檢測分析健康人外周血中sPD-L1的表達水平；流式細胞術(shù)和ELISA分析人Mo-DCs在體外誘導分化成熟過程中膜型PD-L1(mPD-L1)和可溶性PD-L1(sPD-L1)的表達特性；ELISA法檢測分析多種mPD-L1+和mPD-LI-細胞株產(chǎn)生sPD-L1的水平；應(yīng)用免疫沉淀和Westernblot技術(shù)鑒定sPD-L1蛋白的分子量；在高

17、表達sPD-L1的L929/PD-L1和Mo-DCs細胞培養(yǎng)體系中加入金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)，于不同時間分析sPD-L1的表達量；通過與PD-1Ig融合蛋白結(jié)合實驗分析sPD-L1的生物學活性；應(yīng)用CCK-8摻入法體外研究sPD-L1對T細胞增殖和活化的抑制作用；利用sPD-L1ELISA分析該因子在肺癌患者外周血中的表達水平，將獲得的結(jié)果用統(tǒng)計學軟件與各項臨床指標作相關(guān)性分析。
　　 [結(jié)論]人外周血中存在的功能性sPD