適用于熒光蛋白標(biāo)記大樣本的塑性包埋方法研究.pdf

1、獲取高分辨率的小鼠全腦神經(jīng)元連接圖譜對(duì)認(rèn)識(shí)腦的信息處理機(jī)制、疾病致病機(jī)理和發(fā)育異常等具有重要意義。神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)熒光蛋白的小鼠模型是研究腦的結(jié)構(gòu)和功能連接網(wǎng)絡(luò)的有力工具,但現(xiàn)有的成像技術(shù)尚無(wú)法在大范圍內(nèi)獲取熒光蛋白標(biāo)記神經(jīng)元的精細(xì)連接關(guān)系。近年發(fā)展起來(lái)的基于塑性包埋和超薄切片的顯微光學(xué)層析成像技術(shù),典型代表如可實(shí)現(xiàn)亞微米分辨的顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng),被認(rèn)為是目前最有效的對(duì)大體積樣本進(jìn)行微米甚至更高水平的精細(xì)結(jié)構(gòu)三維成像的方法之一。然而

2、,這類技術(shù)還難以應(yīng)用于熒光蛋白標(biāo)記的大樣本(比如完整的小鼠腦),最主要的原因是缺少可行的樣本制備方法。因此,本文旨在發(fā)展一種能適用于熒光蛋白標(biāo)記大樣本的塑性包埋方法,并將其應(yīng)用于小鼠全腦的精細(xì)連接結(jié)構(gòu)研究。
　　針對(duì)樹脂包埋的熒光保持率進(jìn)行了定量測(cè)試和優(yōu)化。本文提出了基于100μm厚的小鼠腦片和雙光子顯微鏡的熒光變化測(cè)量方法。定量研究了黃色熒光蛋白(YellowFluorescentProtein,YFP)經(jīng)六種樹脂分別包埋后的熒

3、光強(qiáng)度變化,發(fā)現(xiàn)這些樹脂的熒光保持率從大到小依次為HPMA、Technovit8100、JB-4、GMA、Unicryl和LRWhite。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化了GMA的配方和使用方法,并首次使得YFP在GMA樹脂包埋后的熒光保持率提高了近一倍。
　　針對(duì)水環(huán)境下樹脂的切片性能進(jìn)行了研究。以顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)平臺(tái),建立了評(píng)估樹脂在水環(huán)境下的切片性能的研究方法,并用于多種樹脂固化塊的水中1μm切片性能研究,研究發(fā)現(xiàn)HPMA、G

4、MA、Unicryl、LRWhite等樹脂可在長(zhǎng)時(shí)間水浸泡條件下進(jìn)行連續(xù)穩(wěn)定的1μm切片。
　　針對(duì)大樣本中樹脂的滲透性能進(jìn)行了研究。以小鼠全腦作為生物大樣本,建立了測(cè)試樹脂在大樣本中的滲透速度的研究方法,并用于評(píng)估不同樹脂的滲透速度,研究發(fā)現(xiàn)LRWhite、Unicryl、GMA在合適的條件下2~3天內(nèi)可充分滲透小鼠全腦,而HPMA滲透小鼠全腦需要2周以上的時(shí)間。
　　基于前述研究結(jié)果,建立了一套完整的適用于熒光蛋白標(biāo)記小

5、鼠全腦的GMA樹脂包埋方法。利用該方法制備的Thy1-eYFP-H小鼠全腦樣品能夠在可實(shí)現(xiàn)熒光成像的顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)中進(jìn)行連續(xù)穩(wěn)定的1μm厚度切片,同時(shí)實(shí)時(shí)采集YFP熒光圖像,最終可獲得體素1μm分辨率的小鼠全腦數(shù)據(jù)集。通過(guò)對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行圖像預(yù)處理和三維重建,可顯示熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)元在小鼠全腦三維空間中的長(zhǎng)程投射路徑。
　　隨著轉(zhuǎn)基因小鼠模型資源的不斷豐富,本文發(fā)展的塑性包埋方法有潛力在獲取哺乳動(dòng)物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)甚至是血管網(wǎng)絡(luò)