白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠腎損傷的保護作用.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructivej aundice，OJ)導致腸黏膜屏障功能損傷，從而產生一系列并發(fā)癥，如敗血癥和腎功能衰竭等。OJ引起腎功能損害的原因未明，可能是由于嚴重肝功能障礙導致腎臟的血流動力學改變所致，其腎臟血流動力學改變的特征是：腎內血管收縮，腎臟血流重新分布，血流自腎皮質向髓質分流，腎皮質缺血，腎小球入球小動脈收縮，腎小球濾過率下降。另外，OJ時可產生腸源性內毒素血癥(endotoxemia，ETM)，膽道梗阻時由于細胞

2、外液及細胞內液的減少以及存在的內毒素血癥從而引起氧自由基增多，導致體內活性氧蓄積并對機體產生損傷作用，機體抗氧化機制不足以清除過多的氧自由基，產生氧化應激損傷而加重腎功能損害。
　　 血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解起始代謝的限速酶。HO在降解血紅素的過程中減少活性氧類物質的產生。在這個過程中它可以產生相同量的一氧化碳和膽綠素，同時釋放出鐵離子。臨床研究表明血紅素的增加可以導致急性腎小管壞死，而HO

3、系統(tǒng)可以減少腎組織損害。HO有三種亞型，HO-1、HO-2、HO-3，其中HO-1為可誘導型。HO-1在氧化應激反應的誘導下產生并對抗氧化應激的損傷。血紅素的代謝產物一氧化碳、膽綠素和鐵離子均具有抗氧化和抗細胞凋亡的作用。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種在桑椹、葡萄和紅酒中發(fā)現并提取出來的多聚苯復合物，已經有研究發(fā)現白藜蘆醇通過誘導HO-1的表達表現出廣泛的生物作用包括抗氧化、抗癌及抗炎癥作用。
　

4、　 目的：本實驗通過研究OJ大鼠腎臟HO-1、ZO-1、occludin表達水平及其在損傷中的作用，探討白藜蘆醇對BDL大鼠腎臟HO-1水平的影響及其在氧化應激損傷中的保護作用及機制。
　　 方法：采用健康雄性wistar大鼠，BDL方法制備動物模型，共60只。白藜蘆醇用1％羧甲基纖維素鈉制成白藜蘆醇混懸液。隨機分為5組：假手術組(sham operation，SO)，膽總管結扎組(BDL)，膽總管結扎+溶劑組(BDL+Veh

5、icle)，膽總管結扎+不同濃度白藜蘆醇組(10mg/kg，20 mg/kg）(BDL+Res10mg/kg，20mg/kg)。分別于術后1wk、2wk留取標本。采用HE染色觀察腎臟形態(tài)學變化；透射電鏡觀察腎臟的超微結構；鱟試劑終點顯色法檢測血漿內毒素(endotoxin，ET)含量；硫代巴比妥酸法檢測腎組織勻漿中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase

6、，SOD)的活力；原位缺口末端標記技術即TUNEL染色檢測腎臟細胞凋亡情況；免疫組織化學(SP)法檢測HO-1及緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達與定位；Real time PCR和western blot方法檢測HO-1在腎臟的表達水平。
　　 (1)肝功能結果證明BDL大鼠模型制作成功。
　　 (2)光鏡下腎組織病理學顯示：BDL組和BDL+Vehicle組大鼠于膽管結扎術后1wk腎近曲小管上皮細胞開始出現

7、輕度腫脹，術后2wk腎近曲小管上皮細胞水腫較1wk時加重。Res治療后腎近曲小管上皮細胞較單純BDL組水腫輕。
　　 (3)透射電鏡觀察腎臟超微結構：BDL組和BDL+Vehicle組大鼠于膽管結扎術后1wk時腎小球濾過屏障表現為基底膜輕度增生，足突及內皮細胞輕度增生融合，近曲小管線粒體大部分嵴和膜融合，可見空泡。粗面內質網有輕度顆粒融合和脫顆?，F象；術后2wk腎小球濾過膜病變加重，足細胞和基底膜重度增生，融合成一片，血管內皮細

8、胞重度增生，近曲小管細胞質內可見大量髓樣化致密化的線粒體。Res組線粒體正常，但粗面內質網仍可見融合和脫顆?，F象。
　　 (4)大鼠血漿內毒素(endotoxin，ET)：BDL組ET水平在各時段明顯高于SO組（P＜0.01），Res10mg/kg，Res20mg/kg組大鼠術后2wkET水平低于同時段BDL組(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (5)內生肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)

9、和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretory，Uaer)：與SO組比較，BDL組血清Ccr水平在術后2wk時明顯下降（P＜0.01），Uaer水平于術后1wk時明顯升高(P＜0.01)，2wk時更顯著(P＜0.001)。BDL+Res2wk治療組Ccr水平較同時相BDL組與BDL+Vehicle組升高（P＜0.05），Uaer水平下降（P＜0.01），但各治療組無明顯差別（P＞0.05）。
　　 (6)腎

10、組織MDA、SOD含量的變化：BDL組腎組織脂質過氧化產物MDA水平在各時段明顯高于SO組(P＜0.01)，SOD活力明顯低于SO組（P＜0.01）；Res組大鼠術后2wkMDA水平低于同時段BDL組(P＜0.05)，SOD活力明顯高于同時段BDL組(P＜0.01)，但各治療組無明顯差別(P＞0.05)。
　　 (7)腎組織ZO-1、occludin免疫組織化學檢測：BDL大鼠術后2wk腎臟ZO-1陽性細胞數減少，光密度(OD)

11、值BDL組（0.10±0.02）明顯低于SO組(0.17±0.00)(P＜0.01)，BDL+Res組（0.12±0.01，0.12±0.01）較同時段BDL組增加（P＜0.05），但各治療之間無明顯差別（P＞0.05）；BDL大鼠術后2wk腎臟occludin陽性細胞數減少，OD值BDL組(0.09±0.02)明顯低于SO組(0.14±0.01)（P＜0.01），BDL+res組（0.12±0.01，0.13±0.01）較同時段BDL

12、組增加（P＜0.01），但各治療組之間無明顯差別(P＞0.05)。
　　 (8)腎組織HO-1免疫組織化學檢測：BDL大鼠在術后2wk大鼠腎臟HO-1陽性細胞數及細胞漿內黃染顆粒增加，OD值BDL組（0.14±0.01）明顯高于SO組（0.05±0.01）（P＜0.01），BDL+res組（0.24±0.03，0.17±0.01）與BDL組比較明顯升高(P＜0.01)，10mg組好于20mg組。
　　 (9)Wester

13、nblot印跡半定量檢測腎組織HO-1表達：Western印跡分析顯示約相對分子質量32kDa處可見雜交蛋白條帶，2wk組BDL組A值百分比(HO-1/GAPDH)（0.63±0.06）高于SO組（0.25±0.07）（P＜0.01），BDL+Res10mg/kg治療組（0.81±0.05）高于同時段BDL組（P＜0.01），10mg組好于20mg組。
　　 (10)Real time PCR分析結果顯示：BDL組大鼠腎組織HO

14、-1mRNA表達（3.76±0.77）高于SO組（1.00±0.00）（P＜0.05），BDL+res10mg/kg組（6.13±1.29）與同時段BDL組比較升高（P＜0.05），10mg組好于20mg組。
　　 結論：
　　 (1)梗阻性黃疸大鼠存在內毒素血癥、腎臟氧化應激損傷和腎臟細胞凋亡。
　　 (2)梗阻性黃疸大鼠腎臟上皮細胞間緊密連接蛋白表達減少。
　　 (3)梗阻性黃疸大鼠腎臟HO-1蛋白及