亞洲棉和陸地棉基因組BAC文庫(kù)的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、含有大片段基因組DNA的BAC文庫(kù)是基因圖位克隆、物理作圖、基因組測(cè)序和新分子標(biāo)記發(fā)掘的重要工具。為了對(duì)棉花基因組進(jìn)行深入地研究，構(gòu)建更多插入片段大、基因組覆蓋率高的BAC文庫(kù)是必不可少的。 本研究在Zhang HB BAC文庫(kù)構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，作了一些改進(jìn)，建立了一套高效的棉花BAC文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)體系，包括高分子量基因組DNA的提取、部分酶切最佳條件的確定、片段大小的選擇、高效連接轉(zhuǎn)化體系等。 利用所建立的高效BAC文庫(kù)

2、構(gòu)建技術(shù)體系，以pIndigoBAC-5為載體，分別選用亞洲棉(基因型A2A2)和陸地棉(基因型AADD)為材料構(gòu)建了基因組BAC文庫(kù)。這些新的BAC文庫(kù)連同已經(jīng)構(gòu)建的棉花的BAC文庫(kù)是棉花基因組研究的重要資源。所構(gòu)建的亞洲棉品種江陵中棉BAC丈庫(kù)，共包括123，648個(gè)單克隆，保存于322塊384孔培養(yǎng)板中。以亞洲棉基因組大小為1690Mb計(jì)算，此文庫(kù)相當(dāng)于7.2倍亞洲棉基因組大小。隨機(jī)挑取103個(gè)單克隆，NotI酶切釋放插入片段，電

3、泳檢測(cè)得到所插入片段范圍為30～190 kb，平均為100.2 kb，空載率<1％。隨機(jī)挑取6個(gè)BAC克隆進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明BAC克隆單個(gè)克隆可以在宿主大腸桿菌中穩(wěn)定繁殖至少100代，不發(fā)生插入片段的丟失和酶切帶型的改變。同時(shí)，為了便于通過PCR技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，還構(gòu)建了該文庫(kù)的混合池?；旌铣胤譃槎?jí)，一級(jí)為行池(Row Pool)和列池(Column Pool)；二級(jí)為超級(jí)混合池?；旌铣氐慕O大地方便了對(duì)文庫(kù)的篩選。

4、 通過篩選江陵中棉BAC文庫(kù)的方法，得到了含有GaMYB7基因的陽性單克隆，以此作為Tail-PCR的起始模板，獲得的總長(zhǎng)度1566bp的GaMYB7基因上游序列。經(jīng)過序列分析確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription Start Site，TSS)、TATA-box和CAAT-box。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含多個(gè)光調(diào)控元件，還具有生長(zhǎng)素和赤霉素應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了3個(gè)5’端含不同應(yīng)答元件的啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因

5、的植物表達(dá)載體。通過基因槍轉(zhuǎn)化棉花胚珠瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)啟動(dòng)子片段均能指導(dǎo)報(bào)告基因在棉花胚珠中正常表達(dá)。因此，GaMYB7啟動(dòng)子可用于研究棉花纖維的發(fā)育、品質(zhì)改良以及外源基因在棉花纖維中的特異表達(dá)。 所構(gòu)建的陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 BAC文庫(kù)共有170，880個(gè)單克隆，保存于445塊384孔中。隨機(jī)挑取110單克隆，用Not I酶切，得到所插入片段范圍為97～240 kb，平均插入片段為122.8 kb；空載率<1％；96

6、％的克隆插入片段>100 kb。以陸地棉基因組大小為2425Mb計(jì)算，此文庫(kù)相當(dāng)于8.6的單倍棉花基因組大小。同樣，為了便于通過PCR技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，構(gòu)建了該文庫(kù)的混合池。Column-Pool庫(kù)保存于19塊384孔板中，每孔由24個(gè)單克隆混合而成，標(biāo)號(hào)為CPl-CP19。Super-pool保存于2塊384孔板中，每孔由384(24×16)個(gè)單克隆混合，共456個(gè)。Giant-pool由Super-pool混合而成，共114個(gè)，每

7、孔由1536(24×16×4)個(gè)單克隆混合而成。從此文庫(kù)中篩選一個(gè)陽性單克隆大約需要158個(gè)PCR反應(yīng)。 陸地棉12號(hào)及26號(hào)染色體系部分同源染色體。目前一些重要的農(nóng)藝性狀基因已被定位在這兩條染色體上。為了圖位克隆這些重要的農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因，需要構(gòu)建這兩條染色體的物理圖譜。我們以遺傳圖譜上定位在這兩條染色體上的分子標(biāo)記進(jìn)行BAC文庫(kù)的篩選，篩選到的陽性單克隆總數(shù)為607個(gè)，平均為每個(gè)標(biāo)記約4個(gè)克隆。各個(gè)標(biāo)記篩到的陽性單克隆數(shù)從

8、1到16個(gè)。12和26號(hào)染色體上共有的克隆共68個(gè)。有共同克隆的標(biāo)記分為21組，49個(gè)標(biāo)記。通過比較發(fā)現(xiàn)，這些篩選到相同克隆的標(biāo)記一般在遺傳圖譜上的遺傳距離也比較近，這也驗(yàn)證了遺傳圖譜的準(zhǔn)確性。還有一些標(biāo)記如NAU3294和NAU3293，BNL1673和NAU1463，NAU4095和NAU3905，NAU3441和NAU3442，分別位于不同的染色體上，但是也篩選到了共同的克隆，說明這一對(duì)引物所處的位置為同源染色體區(qū)段。這也證明了1