非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、非洲豬瘟(ASF)由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起，死亡率高達(dá)100％。由于該病毒特殊的免疫逃避機(jī)制，目前尚無有效治療手段。雖然我國(guó)并無ASF疫情，但隨著各種國(guó)際交往的增多，受到該病威脅的可能性也越來越大，建立一種高效靈敏，簡(jiǎn)便快捷的非洲豬瘟檢測(cè)技術(shù)具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)因其獨(dú)特的設(shè)計(jì)被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于非洲豬瘟LAMP檢測(cè)方法的報(bào)道。因此本研究建立的ASFV-LAMP方法不但具有實(shí)際

2、應(yīng)用價(jià)值，也具有較高的科研意義。 非洲豬瘟P72基因高度保守，是建立核酸快速檢測(cè)方法的理想位點(diǎn)。本研究利用生物信息學(xué)手段選定了P72基因C端保守序列的一部分作為靶序列，通過PrimerExplorer3.0軟件分析，依據(jù)GC含量，末端穩(wěn)定性，二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)，設(shè)計(jì)篩選出了4套LAMP引物。由于LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大都在100到300bp，一旦出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則很難分辨。因此本研究為每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)用于后續(xù)的鑒定，以保

3、證實(shí)驗(yàn)的可靠性。以LAMP保守參數(shù)進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果表明，四套引物中4FIP，4BIP，4F3，4B3引物組擴(kuò)增效率最佳，產(chǎn)物條帶清晰明顯，且酶切片段大小與預(yù)期相符。 使用該引物組建立ASFV-LAMP方法，對(duì)LAMP實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。包括溫度、鎂離子濃度、內(nèi)外引物和甜菜堿濃度等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎂離子和內(nèi)引物濃度對(duì)擴(kuò)增效率影響最為明顯，在鎂離子濃度為8mM，內(nèi)引物濃度為1.6～2.4μM時(shí)效果最好；擴(kuò)增效率雖與內(nèi)引物濃

4、度呈正相關(guān)，但當(dāng)內(nèi)引物濃度超過3.0μM以后，反而對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。溫度、外引物、甜菜堿等雖然也能提高擴(kuò)增效率，但梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)數(shù)值達(dá)到一定程度后，影響便不明顯，因此在出現(xiàn)清晰陽(yáng)性條帶的實(shí)驗(yàn)組中取中間值作為ASFV-LAMP方法的參數(shù)，即溫度63℃，外引物終濃度0.2μM，甜菜堿濃度1.0M。 在上述優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，初步建立ASFV-LAMP方法。以O(shè)IE標(biāo)準(zhǔn)ASFV-PCR檢測(cè)方法為參照，進(jìn)一步進(jìn)行時(shí)間、靈敏度、特異性

5、及可靠性實(shí)驗(yàn)。時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)顯示，該方法只需要30分鐘即可完成，大大少于參照PCR方法；對(duì)梯度稀釋模板的檢測(cè)表明，ASFV-LAMP能夠檢測(cè)到5拷貝的模板，且在低拷貝模板檢測(cè)中加入Loop引物，能使擴(kuò)增效率提高至與高拷貝模板相同的水平，而參照的PCR法只能檢測(cè)到500個(gè)拷貝的模板，ASFV-LAMP的靈敏度是參照PCR的100倍；以豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒等常見豬DNA病毒基因組為模板進(jìn)行特異性試驗(yàn)，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；