三種高揮發(fā)性大蒜有機硫化合物的分析鑒定及其抑制人肺癌細胞H460增生的機制研究.pdf

1、大蒜是百合科蔥屬植物生蒜的地下鱗莖，多年的流行病學(xué)研究及臨床實驗發(fā)現(xiàn)大蒜具有抗癌防癌、抗動脈粥樣硬化、降血壓降血脂、抗菌和提高機體免疫力等多種藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜的藥理作用與它含有的揮發(fā)性有機硫化物成分有密不可分的關(guān)系。大蒜中的有機硫化物主要是烯丙基硫化物，包括二烯丙基二硫醚(DADS)，二烯丙基硫醚(DAS)等，這些硫化物可以抑制多種腫瘤細胞的生長，但其作用機制以及構(gòu)效關(guān)系并不十分清楚。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在多種大蒜制

2、劑中室溫條件下檢測到的、高含量的高揮發(fā)性有機硫化合物包括二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)以及二烯丙基二硫醚(DADS)，以AMDS含量為最高。為了進一步探索這三種大蒜有機硫化合物作為新型藥物的可行性，本課題首先利用了GC-MS對人工合成的DADS，AMDS及DAS三種有機硫化合物進行了純度鑒定、雜質(zhì)分析，對它們在25℃、4℃及-20℃條件下的穩(wěn)定性進行了評價。本課題的第二部分研究內(nèi)容是對該三種大蒜有機硫化合物進行了肺

3、癌細胞H460生物學(xué)活性的評價;構(gòu)效關(guān)系的研究包括該三種有機硫化合物對人大細胞肺癌H460細胞的抑制、凋亡、細胞周期等生物機制的探索。
　　有機硫化合物的GC-MS純度檢測結(jié)果得知DADS、AMDS、DAS的純度分別為98.8％、96.5％、100.0％。雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)表明DADS中的主要雜質(zhì)為DAS(1.2％);而AMDS中的主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定為DADS(2.2％)和1-丙烯基甲基二硫醚(MPDS，1.3％)。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯

4、示三種有機硫化合物DADS，AMDS及DAS在25℃條件下均不穩(wěn)定，AMDS尤其不穩(wěn)定，三個月內(nèi)的純度已經(jīng)下降到50％以下;而三種化合物在-20℃條件下保存三個月后純度下降都在2％范圍內(nèi)，因此三種化合物在實驗過程中應(yīng)保存在-20條件下。
　　近年來，化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及阻滯細胞周期的機制研究成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物生物學(xué)研究的熱點。本課題以人大細胞肺癌H460細胞為研究對象，探索了三種有機硫化合物對肺癌H460細胞的

5、抑制、凋亡、細胞周期等誘導(dǎo)肺癌細胞信號通路、阻滯細胞周期的機制。采用SRB法檢測了在50-600μM濃度范圍內(nèi)DADS，AMDS及DAS分別作用于H460細胞24、48、72h后對細胞的抑制作用，600μM的DADS在72h對H460細胞的最高抑制率為74.8％，600μM的AMDS在72h對H460細胞的最高抑制率為65.3％，DAS在600μM范圍內(nèi)對H460細胞沒有抑制作用，三者對H460細胞的抑制作用大小順序為DADS＞AMDS

6、＞DAS。使用倒置顯微鏡對DADS，AMDS及DAS在不同作用濃度和作用時間下對H460細胞形態(tài)的影響進行了觀察，研究發(fā)現(xiàn)DADS和AMDS的作用可以使H460細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞收縮變圓，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，圓形細胞的數(shù)目越來越多，且細胞有變大的現(xiàn)象。DAPI染色測定結(jié)果顯示400μM的DADS和AMDS處理H460細胞后，細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，核固縮等現(xiàn)象，并有典型的凋亡小體產(chǎn)生，DAS即使在600μM范圍內(nèi)也并不能引起H460

7、細胞產(chǎn)生凋亡小體，由此可知，DADS和AMDS對H460細胞的抑制作用是通過誘導(dǎo)H460細胞凋亡引起的。FITC-AnnexinⅤ/PI雙熒光染色法測定結(jié)果表明隨著DADS和AMDS濃度的增加，H460細胞的凋亡率也隨之增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系，而在600μM濃度范圍內(nèi)的DAS不能引起細胞凋亡。Ellisa試劑盒測定結(jié)果顯示300μ.M和600μM的DADS和AMDS可以顯著地提高了caspase3、caspase8、caspase

8、9的表達量，存在劑量依賴關(guān)系，600μM的DAS則沒有該作用;流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示DADS和AMDS處理組細胞的線粒體膜電位降低，細胞內(nèi)反應(yīng)活性氧的水平升高，600μM的DAS則對兩者沒有作用;Westernblotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)DADS和AMDS顯著地降低了Bcl-2、Bcl-(X)L蛋白的表達水平，增加了Bax蛋白的表達，對促凋亡分子的細胞色素C(Cytochromec)的表達量也有所提高，同時提高了死亡受體途徑中FADD蛋

9、白的表達水平;RT-PCR檢測法進一步證實了DADS和AMDS也可以在mRNA水平上降低Bcl-2的表達水平，增加Bax的表達水平，同時增加了caspase3及FADD的表達水平，由此說明，線粒體途徑與死亡受體途徑同時參與了H460細胞的凋亡過程。PI染色后流式細胞術(shù)檢測數(shù)據(jù)顯示DADS和AMDS將H460細胞阻滯于G2/M期，DAS在600μM范圍內(nèi)對H460細胞無周期阻滯作用。Westernblotting實驗結(jié)果顯示DADS和AM

10、DS可顯著地上調(diào)了p53及p21蛋白的表達量，下調(diào)了PCNA、CyclinB1、CyclinA2蛋白的表達量，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。同時，DADS和AMDS能提高CyclinB1的mRNA水平。劃痕實驗結(jié)果顯示，DADS和AMDS顯著地增加了24h后細胞的劃痕的寬度，而600μM范圍內(nèi)的DAS則對劃痕寬度無影響，Westernblotting檢測數(shù)據(jù)表明DADS和AMDS可以提高E-cadherin黏附蛋白的表達量。
　　綜上所述，所

11、評價的大蒜有機硫化合物二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)、二烯丙基二硫醚(DADS)批次的純度已達到或接近作為單一藥物的要求，但它們的穩(wěn)定性有待通過特殊制劑技術(shù)來進一步提高。這三種有機硫化合物對肺癌細胞H460的生物活性研究表明，DADS和AMDS能夠有效地抑制H460細胞增生，而DAS的抗腫瘤效果非常有限。DADS和AMDS可以將肺癌細胞H460阻滯于G2/M期，這種細胞周期阻滯作用與DADS及AMDS上調(diào)p53及p