高抗凝、可誘導(dǎo)再生小口徑人工血管的研究.pdf

1、目的：血管疾病是世界上發(fā)病率最高的疾病之一，而血管移植術(shù)是其目前主要的治療手段。臨床上應(yīng)用的血管移植術(shù)材料主要來源為自體血管、異體血管和人工材料。目前，大、中口徑人工血管移植應(yīng)用效果較好，而小口徑移植血管（直徑<6mm）易發(fā)生吻合口內(nèi)膜增生以及血栓形成，遠(yuǎn)期通暢率不理想。血管組織工程技術(shù)為血管移植術(shù)所需材料、特別是小口徑血管，提供了新途徑。但目前，構(gòu)建小口徑組織工程化血管仍不盡如人意，如在人工血管內(nèi)壁種植血管內(nèi)皮細(xì)胞周期較長，短期內(nèi)不能

2、形成完整內(nèi)膜，無法滿足臨床需求，而且同樣存在遠(yuǎn)期通暢率不理想等問題。為此本課題將新鮮牛心包用于體外實(shí)驗(yàn)研究，將豬來源小口徑血管用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用組織工程中的脫細(xì)胞技術(shù)和化學(xué)交聯(lián)技術(shù)進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)行肝素結(jié)合以及負(fù)載生長因子等改性處理，以期短期高效地制備出具有抗凝血活性、可誘導(dǎo)自體內(nèi)皮再生的小口徑人工血管。
　　 方法：
　　 （一）材料前期處理：反復(fù)凍融+TritonX-100聯(lián)合作用對新鮮牛心包膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，行

3、HE染色后光鏡下觀察脫細(xì)胞效果；采用碳化二亞胺（EDC）作為交聯(lián)劑，交聯(lián)脫細(xì)胞牛心包膜，并通過生物力學(xué)檢測、體外膠原酶降解實(shí)驗(yàn)以及變性溫度測試考察交聯(lián)程度。
　　 （二）材料表面肝素化處理，采用三種途徑負(fù)載肝素：（1）EDC共價(jià)鍵合肝素；（2）聚乙烯亞胺（PEI，MW=1800D，10kD，20kD）離子結(jié)合肝素；（3）EDC-PEI共價(jià)-離子聯(lián)合負(fù)載肝素，即在EDC共價(jià)鍵合肝素基礎(chǔ)上再采用PEI離子結(jié)合肝素。采用電感耦合等離子

4、體質(zhì)譜儀（ICP-MS）和紅外光譜評價(jià)材料負(fù)載肝素情況，采用接觸角測量儀評價(jià)材料表面的親疏水性，檢測肝素化材料的含水量，并通過溶血試驗(yàn)、血小板粘附實(shí)驗(yàn)、抗凝血時(shí)間、復(fù)鈣時(shí)間及細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價(jià)材料的血液相容性及細(xì)胞相容性。
　　 （三）肝素化材料負(fù)載血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF165）實(shí)驗(yàn)，分別考察EDC共價(jià)鍵合肝素、PEI離子結(jié)合肝素以及共價(jià)-離子聯(lián)合肝素化材料對碘標(biāo)記VEGF165（125I-VEGF165）的控制釋放能力，

5、并進(jìn)行促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
　　 （四）將篩選出的最佳肝素化方式運(yùn)用到小口徑異種血管的表面改性，通過對犬實(shí)施血管置換手術(shù)觀察這種小口徑異種血管的可行性。
　　 結(jié)果：
　　 （一）光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，材料中的細(xì)胞脫除徹底，細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整，排列有序，表明反復(fù)凍融+TritonX-100聯(lián)合作用是一種有效、經(jīng)濟(jì)、快捷的脫細(xì)胞方法。脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)EDC交聯(lián)處理后，力學(xué)性能及變性溫度較新鮮牛心包顯著提高且具有

6、良好的抗降解性能。
　　 （二）PEI離子結(jié)合肝素量與結(jié)合層數(shù)呈正相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)結(jié)合層數(shù)達(dá)到所需肝素量要求，而EDC共價(jià)鍵合肝素量為定值，與PEI離子結(jié)合肝素層數(shù)達(dá)到18層左右時(shí)的肝素量相當(dāng)。此外，采用三種分子量的PEI分別進(jìn)行離子結(jié)合15層肝素處理，含水量及接觸角測試結(jié)果表明PEI1800D處理組含水能力和親水性能均優(yōu)于PEI10kD、PEI20kD處理組；溶血試驗(yàn)中，PEI1800D溶血率為2.66％，PEI10kD溶血率

7、為5.02％，PEI20kD溶血率為5.58％，表明PEI1800D溶血試驗(yàn)合格。通過上述實(shí)驗(yàn)篩選出PEI1800D作為陽離子劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別對交聯(lián)對照組、EDC共價(jià)鍵合肝素組、PEI1800D離子結(jié)合肝素組、EDC.PEI1800D聯(lián)合負(fù)載肝素組進(jìn)行溶血試驗(yàn)、血小板粘附、凝血時(shí)間、復(fù)鈣時(shí)間測試，發(fā)現(xiàn)EDC共價(jià)鍵合肝素組溶血試驗(yàn)不合格；EDC-PEI1800D聯(lián)合負(fù)載肝素組抗凝血效果最佳，經(jīng)過長時(shí)間生理鹽水浸泡（15d），該組抗凝血

8、性能保持最好。細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，PEI1800D離子結(jié)合肝素組為0.5級，EDC-PEI1800D聯(lián)合負(fù)載肝素組為1.0級，細(xì)胞毒性試驗(yàn)合格，優(yōu)于EDC共價(jià)鍵合肝素組的1.3級。
　　 （三）肝素化材料對VEGF165控釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EDC共價(jià)鍵合肝素對VEGF165的控釋力優(yōu)于PEI1800D離子結(jié)合肝素組，驗(yàn)證了共價(jià)鍵合穩(wěn)定性高于離子結(jié)合方式，因此，采用EDC-PEI聯(lián)合負(fù)載肝素方式可以彌補(bǔ)單純使用離子結(jié)合肝素穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)

9、。內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EDC-PEI1800D聯(lián)合負(fù)載肝素結(jié)合VEGF165組促細(xì)胞增殖力最好。
　　 （四）結(jié)合VEGF165的EDC-PEI1800D聯(lián)合肝素化小口徑血管移植后，短期觀察通暢效果良好，需要進(jìn)一步長期觀察。
　　 結(jié)論： EDC-PEI1800D聯(lián)合負(fù)載肝素結(jié)合VEGF165方式具有良好的抗凝血性、促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力，同時(shí)具有一定的降解性能和適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，制備周期短，凍干滅菌后可室溫長期保存，為小