基于慢性疲勞綜合征線蟲模型的中藥篩選及單體藥效研究.pdf

1、背景:慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)由美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)于1988年正式命名，是一種持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月的原因不明的精神及軀體的亞健康狀態(tài)，以疲勞、低熱（或自覺發(fā)熱）、咽喉痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛、注意力不易集中、記憶力差、睡眠障礙和抑郁等非特異性表現(xiàn)為主的綜合征，無(wú)法自行緩解，臨床檢查多無(wú)明顯器質(zhì)性改變。近年來(lái)隨著社會(huì)生活方式改變，環(huán)境惡化等多方面因素影響，CFS發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨

2、勢(shì)，好發(fā)年齡為30-50歲之間的青壯年階段，是白領(lǐng)工作人群早衰、猝死的重要危險(xiǎn)因素，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CFS的防治措施十分有限。在中醫(yī)學(xué)中，CFS屬于“虛勞”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就對(duì)該類癥狀有詳細(xì)描述，治療方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為CFS的病機(jī)以腎精虧虛為主，治療上多以補(bǔ)腎填精益氣為主，且處方用藥以自擬方和大方為主，對(duì)中藥資源的合理使用及CFS的中醫(yī)診療規(guī)范化均十分不利。因此從臨床治療常用方藥中篩選鑒定出對(duì)CFS具有確切療效的

3、中藥具有重要意義。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，小鼠CFS模型成本高、周期長(zhǎng)、造模方式復(fù)雜且效果不夠穩(wěn)定，不適合作為初期的藥物篩選模型，而秀麗隱桿線蟲作為一種國(guó)際通用的模式生物，具有完整的神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)、消化和生殖系統(tǒng)，遺傳背景清晰，整體生命功能活動(dòng)及相關(guān)調(diào)控路徑與人類具有高度同源性，且生存周期短，成本較低，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求，樣本量充足，可控性強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因操作靈活，可以觀察到慢性應(yīng)激疾病逐步進(jìn)展對(duì)線蟲壽命、行為、群體等多方面的影響，是適宜研究CFS的良好素

4、材。本研究引入簡(jiǎn)單模式生物秀麗線蟲及其轉(zhuǎn)基因株進(jìn)行CFS相關(guān)研究。Aβ1-42轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲株能模擬蛋白穩(wěn)態(tài)失衡所致CFS病理表現(xiàn)，結(jié)合線蟲生存狀態(tài)，能體現(xiàn)CFS縮短健康生存時(shí)間的整體疾病轉(zhuǎn)歸，并且成本低、周期短、檢測(cè)指標(biāo)穩(wěn)定，是進(jìn)行CFS相關(guān)藥物篩選的合適模型。本研究旨在嘗試?yán)镁€蟲模型篩選防治CFS中藥，并對(duì)藥物對(duì)CFS干預(yù)效果進(jìn)行初步探索，為擴(kuò)展后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。
　　目的:1.嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因線蟲模型模擬CFS蛋白穩(wěn)態(tài)失衡的

5、病理環(huán)節(jié)，篩選防治CFS的有效中藥;
　　2.利用多種應(yīng)激線蟲模型模擬CFS相關(guān)病理環(huán)節(jié)，以篩選出的補(bǔ)腎中藥制何首烏為例，探討其主要有效單體成分二苯乙烯苷對(duì)CFS線蟲模型的防治效果。
　　方法:1.中藥篩選實(shí)驗(yàn):利用蛋白失衡應(yīng)激模型轉(zhuǎn)基因線蟲CL4176篩選藥物，分組為對(duì)照組及藥物干預(yù)各劑量組，對(duì)17種藥物進(jìn)行干預(yù)效果檢測(cè)，觀察蛋白毒性誘導(dǎo)的應(yīng)激模式下，藥物對(duì)線蟲平均非癱瘓時(shí)間的作用效果;
　　2.在高、中、低劑量組（

6、TSG-125μM組、TSG-62.5μM組、TSG-25μM組）二苯乙烯苷干預(yù)下，觀察成年線蟲對(duì)體外環(huán)境的熱應(yīng)激(35℃)、氧化應(yīng)激（胡桃醌250μg/mL）及體內(nèi)毒性蛋白應(yīng)激（Aβ1-42轉(zhuǎn)基因突變株CL4176）的耐受能力和平均存活時(shí)間，并進(jìn)一步評(píng)估二苯乙烯苷對(duì)正常狀態(tài)下線蟲平均生存時(shí)間、30 s運(yùn)動(dòng)距離、第4天和第10天線蟲肌肉細(xì)胞GFP數(shù)目、30s咽泵運(yùn)動(dòng)頻次及生殖能力的作用效果。
　　結(jié)果:1.利用蛋白失衡應(yīng)激模型轉(zhuǎn)基

7、因線蟲CL4176進(jìn)行中藥篩選:中藥顆粒溶液直接添加入線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，從17種單味中藥顆粒中篩選出2種可延長(zhǎng)線蟲模型平均非癱瘓時(shí)間的藥物:淫羊藿、制何首烏，以制何首烏效果最佳。
　　2.與空白對(duì)照組比較，二苯乙烯苷TSG-125μM組、TSG-62.5μM組可減輕蛋白毒性作用(P＜0.05)，高中低干預(yù)各組均能增加線蟲熱應(yīng)激存活時(shí)間(P＜0.05)，TSG-125μ M組可增加線蟲氧化應(yīng)激存活時(shí)間(P＜0.05)、TSG可右移野生

8、型線蟲的生存曲線，延長(zhǎng)線蟲平均生存時(shí)間及最大生存時(shí)間(P＜0.05)。與對(duì)照組比，高濃度干預(yù)組能增加線蟲的運(yùn)動(dòng)距離和咽泵運(yùn)動(dòng)頻次（P＜0.05），延緩線蟲第4天和第10天肌肉細(xì)胞核GFP熒光強(qiáng)度和數(shù)目的衰減（P＜0.05）。生殖能力各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.在利用轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CFS模型篩選17種單味中藥顆粒過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)淫羊藿、制何首烏均可延長(zhǎng)線蟲模型平均非癱瘓時(shí)間，以制何首烏效果最佳。