小劑量槲皮素聯(lián)合順鉑對惡性黑素瘤A375細(xì)胞抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文小劑量槲皮素聯(lián)合順鉑對惡性黑素瘤A375細(xì)胞抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：高聰普申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：皮膚病與性病學(xué)指導(dǎo)教師：于建斌20060501鄭州大學(xué)2006屆碩士畢業(yè)論文摘要惡性黑素瘤化療敏感性還未見報道。本實(shí)驗(yàn)以小劑量槲皮素及順鉑處理惡性黑素瘤A375細(xì)胞系，探討小劑量槲皮素能否增加順鉑對惡性黑素瘤增強(qiáng)化療敏感性及其可能的機(jī)制，為臨床治療尋找新的治療途徑，積累研究資料和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1細(xì)胞培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)采

2、用A375細(xì)胞傳代貼壁培養(yǎng)，接種入24孔培養(yǎng)板，在細(xì)胞對數(shù)生長期，隨機(jī)將24孔分為4組。對照組：加不含順鉑和槲皮素的培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM)；槲皮素組：加入含槲皮素(槲皮素終濃度為30岬ol／L)的培養(yǎng)基：順鉑組：加入含順鉑(終濃度為1mol／L)的培養(yǎng)基；聯(lián)合組：同時加入含槲皮素，順鉑(終濃度：槲皮素30肛m01／L，順鉑1“m01／L)培養(yǎng)基。4組細(xì)胞同時培養(yǎng)36h。2生長抑制率檢測：細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組如前述，先棄去培養(yǎng)

3、液，24孔板每孔加入O2m10，005％胰蛋白酶O02％EDTA消化液輕搖幾下棄去，再加入O4mlO05％胰蛋白酶002％EDTA消化液消化，最后加入O4％臺盼藍(lán)O1ml，充分吹打使其混勻。將上述混懸液充入血細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，置于顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞，每孔計算活細(xì)胞數(shù)，生長抑制率=(空白對照活細(xì)胞數(shù)一治療組的活細(xì)胞數(shù))／空白對照活細(xì)胞數(shù)。重復(fù)10次。3TuNEL檢測細(xì)胞凋亡：采用A375細(xì)胞傳代貼壁培養(yǎng)于75cnl2細(xì)胞瓶中，在用細(xì)胞混懸液5

4、ul滴在用鉻礬明膠包被好的片子鋪勻，立即4％多聚甲醛固，固定好的細(xì)胞滴片標(biāo)本，在高冷風(fēng)下吹干，先用03％Tritonx100／PBS作用20min，用5pg／ml蛋白酶K作用，用4％多聚甲醛后固定，用TdT酶和生物素標(biāo)記的duTP4℃孵育過夜，第二天用l％乙酰化酶BsA及新稀釋的l：1000鹼性磷酸孵育，用NBT／BcIP作為凋亡的顯示信號。陰性對照不加TdT酶，僅加TdT緩沖液。，，4細(xì)胞免疫組化：采用A375細(xì)胞傳代貼壁培養(yǎng)于75c