B29菌株LPS合成基因缺失突變株的構(gòu)建及分析.pdf

1、脂多糖(LPS)在革蘭氏陰性細(xì)菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有對腸桿菌屬 LPS結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)道。本研究試圖構(gòu)建能引起肥胖的陰溝腸桿菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突變株,以了解突變體菌株產(chǎn)生的LPS結(jié)構(gòu)與活性與野生菌株產(chǎn)生的LPS的差異。根據(jù)同源重組技術(shù)的原理,利用PCR擴(kuò)增 B29的waaL和waaG基因上下游同源臂,并與廣宿主自殺性質(zhì)粒構(gòu)建敲除載體 pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,將敲除載體

2、電擊轉(zhuǎn)入E.coli SM10菌株并使其與B29菌株共同培養(yǎng),再經(jīng)過抗生素和蔗糖培養(yǎng)篩選waaL和waaG基因缺失突變株,并利用多重 PCR、ERIC-PCR、PCR-DGGE、DNA測序?qū)ν蛔冎赀M(jìn)行驗(yàn)證。用生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)比較野生株與突變株在脂多糖結(jié)構(gòu)、內(nèi)毒素活性、生長速率等方面的差異。
　　多重PCR、ERIC-PCR、PCR-DGGE、DNA測序結(jié)果證實(shí)waaL和waaG基因的敲除突變株B29△waaL和B29△waaG構(gòu)建成

3、功,銀染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 B29菌株的脂多糖為光滑型結(jié)構(gòu),而突變株的LPS分子量大小要明顯小于野生型菌株,尤其是B29△waaG突變株;而基質(zhì)顯色鱟試劑法(LAL)檢測 LPS的內(nèi)毒素活性發(fā)現(xiàn),突變株的內(nèi)毒素活性與野生型相比有較大幅度下降;生長曲線測定結(jié)果表明B29△waaL突變株的生長速率與野生型相當(dāng),而B29△waaG突變株的生長速率則相對降低。構(gòu)建了LPS結(jié)構(gòu)改變、內(nèi)毒素活性下降的陰溝腸桿菌B29菌株的突變株B29△waaL和B29△