海洋微生物極端酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、　　海洋是一個(gè)十分獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境,包羅了寡營養(yǎng)、高鹽、高壓、低光照、低溫(尤其深海)、無光照以及局部高溫等各種極端環(huán)境。海洋微生物資源以其廣闊的應(yīng)用前景,促使世界各國和組織對(duì)其進(jìn)行大量的研究。來自海洋的微生物大部分都適應(yīng)了極端環(huán)境條件,能夠產(chǎn)生各種獨(dú)特的生物活性物質(zhì)。海洋微生物的多樣性豐富,已發(fā)現(xiàn)的類群主要包括：細(xì)菌、真菌、古菌、微藻、病毒。物種的多樣性決定了其代謝產(chǎn)物的多樣性,因此,海洋是極端生物酶的重要來源。
　　本文從我國

2、天津近海鹽田分離得到一株產(chǎn)蛋白酶的菌株SY-7,通過 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,該菌株16S rRNA基因序列與Thalassobacillus devorans相似性為98.88%,為革蘭氏陽性菌。最適生長溫度為30℃、最適生長pH 7.5,最適NaCl為10%。對(duì)SY-7胞外蛋白酶經(jīng)行了酶學(xué)性質(zhì)研究,最適反應(yīng)溫度、pH值分別為45℃,7.5~9.0, 40℃具有良好的穩(wěn)定性。SY-7蛋白酶基本不受反應(yīng)體系NaCl的濃

3、度的影響。EDTA,絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF抑制酶活,巰基乙醇影響微弱。Ca2+、Mg2+激活作用明顯,Na+、K+對(duì)酶活基本沒有影響。而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Ni+ 和Hg2+則能抑制酶活,其中Hg2+表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。螯合劑EDTA明顯抑制酶活。利用PB設(shè)計(jì)從眾多的影響因素篩選出得到影響較大的3個(gè)因素：葡萄糖含量、接種量、裝液量；再利用響應(yīng)面法中的雜合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化,通過擬合得到響應(yīng)曲面函

4、數(shù),獲得了最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在該實(shí)驗(yàn)條件下酶活從870 U/mL提高到1390 U/mL,實(shí)際酶活力達(dá)到理論預(yù)測值的98.5%,優(yōu)化效果較好。通過五升罐小試,在最佳試驗(yàn)條件下酶活可達(dá)到1230U/L。
　　本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的深海低溫脂肪酶基因工程菌lip001進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化。確定了培養(yǎng)基為橄欖油1%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、硫酸銨0.5%、磷酸鹽0.5%、MgSO4為0.5%、氯霉素12.5μg/mL為最優(yōu)發(fā)酵條件,優(yōu)

5、化后的脂肪酶活為1980 U/mL,比優(yōu)化前提高了54.7%,為大規(guī)模發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。采用5L發(fā)酵罐方法試驗(yàn),酶活達(dá)到2420 U/mL。采用50L發(fā)酵罐方法試驗(yàn),酶活達(dá)到5620 U/mL。采用500L發(fā)酵罐方法試驗(yàn),酶活達(dá)到5120 U/mL。該低溫脂肪酶的最適反應(yīng)溫度30℃,pH值為8.5~9.0,50℃及以上表現(xiàn)熱不穩(wěn)定性,具低溫堿性脂肪酶性質(zhì)。高濃度SDS、Tween-80、尿素、鹽酸胍和EDTA抑制酶活,巰基乙醇影響微弱。C