費(fèi)氏丙酸桿菌離位轉(zhuǎn)化維生素B12的工藝研究.pdf

1、費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）代謝合成維生素B12（Ado-cbl）的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生以丙酸為主的副產(chǎn)物，且丙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)具有一定的反饋抑制作用。發(fā)酵過(guò)程中如何降低丙酸的反饋抑制作用，提高費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵的過(guò)程經(jīng)濟(jì)性是一個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)費(fèi)氏丙酸桿菌“邊分離、邊轉(zhuǎn)化、邊發(fā)酵”的半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，本研究提出采用細(xì)胞離位轉(zhuǎn)化的方式來(lái)進(jìn)行維生素B12的合成，即當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)，將菌

2、體細(xì)胞從發(fā)酵液中分離出來(lái)，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)反應(yīng)體系中，加入5,6-二甲基苯并咪唑（5,6-Dimethylbenzimida-zole, DMB）進(jìn)行維生素B12的合成，從而在分批補(bǔ)料發(fā)酵的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)費(fèi)氏丙酸桿菌的半連續(xù)發(fā)酵。本文首先通過(guò)研究代謝中間體脫氧腺苷咕啉醇酰胺（Ado-cbi）與產(chǎn)物維生素B12的關(guān)系考察了費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞離位轉(zhuǎn)化合成維生素B12的可行性，并從細(xì)胞分離時(shí)機(jī)、分離方式、離位轉(zhuǎn)化體系等方面進(jìn)行了優(yōu)化，為費(fèi)氏丙酸桿菌的半

3、連續(xù)發(fā)酵雙產(chǎn)物耦合分離發(fā)酵工藝奠定了前提條件。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴優(yōu)化HPLC檢測(cè)方法，將洗脫條件改為0-30min，5-24％乙腈梯度洗脫。通過(guò)維生素B12轉(zhuǎn)化過(guò)程中添加DMB后中間體Ado-cbi與產(chǎn)物維生素B12的關(guān)系找到了中間體Ado-cbi的檢測(cè)峰。使用液-質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）質(zhì)譜分析測(cè)定了檢測(cè)峰分子質(zhì)量為1239.3，與中間體Ado-cbi的分子質(zhì)量一致。由此可以同時(shí)而且實(shí)時(shí)檢測(cè)代謝中間Ado-cbi以及產(chǎn)

4、物維生素B12。⑵通過(guò)對(duì)DMB添加時(shí)機(jī)以及添加量的研究確定了費(fèi)氏丙酸桿菌轉(zhuǎn)化維生素B12時(shí)DMB的最適添加時(shí)機(jī)為發(fā)酵84h，最適添加量為0.9mg/L。研究了發(fā)酵初添加DMB策略，DMB補(bǔ)加策略以及DMB連續(xù)添加策略，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化初期DMB在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)化速率有一定影響，發(fā)酵初添加DMB會(huì)大大降低維生素B12的產(chǎn)量，在轉(zhuǎn)化時(shí)以直接添加足量（0.9mg/L）DMB的添加方式為最優(yōu)。⑶為建立費(fèi)氏丙酸桿菌的半連續(xù)發(fā)酵雙產(chǎn)物耦合分離發(fā)酵工藝，