平滑肌肌球蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)機(jī)理.pdf

1、平滑肌肌球蛋白(smooth muscle myosin，SmM)是一種重要的分子馬達(dá)，是平滑肌粗絲的主要成分。通過(guò)與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的相互作用，SmM可以將ATP水解產(chǎn)生的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成構(gòu)象變化，使粗絲-細(xì)絲間發(fā)生相互滑動(dòng)，引起平滑肌收縮。
　　SmM由兩條重鏈、兩條必需輕鏈(Essential light chain，ELC)、以及兩條調(diào)節(jié)輕鏈(Regulatory light chain，RLC)組成。SmM重鏈包括位于N端的馬達(dá)

2、頭部（包含ATP水解酶活性中心和細(xì)絲結(jié)合位點(diǎn)）、輕鏈ELC和RLC結(jié)合位點(diǎn)、以及C端的卷曲螺旋(coiled-coil)。SmM的馬達(dá)功能受磷酸化調(diào)節(jié)。在非磷酸化狀態(tài)下，SmM的馬達(dá)活性處于抑制狀態(tài)，其ATP水解酶活力極低;當(dāng)SmM的RLC輕鏈被磷酸化后，SmM的馬達(dá)活性處于高活性狀態(tài)，具有很高的ATP水解酶活力。大量的研究表明，非磷酸化狀態(tài)下，SmM的雙頭之間以及頭部與尾部之間存在相互作用，使SmM處于折疊抑制狀態(tài);RLC磷酸化后，上

3、述相互作用消失，SmM處于伸展激活狀態(tài)。由于磷酸化位點(diǎn)位于RLC輕鏈，與ATP水解酶活性中心相距甚遠(yuǎn)，一個(gè)重要問(wèn)題是RLC磷酸化如何調(diào)節(jié)ATP水解酶活性。
　　首先，本論文研究了雙頭結(jié)構(gòu)在SmM磷酸化調(diào)節(jié)中的作用。由于早期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帶有一個(gè)馬達(dá)頭部的SmM（如單頭SmM、S1）的馬達(dá)活性不受磷酸化調(diào)節(jié)，并且始終處于高活性狀態(tài)，因此普遍認(rèn)為SmM的默認(rèn)狀態(tài)是高活性狀態(tài);非磷酸化狀態(tài)下，SmM的雙頭之間以及頭部與尾部之間的相互作用使其

4、處于抑制狀態(tài);一旦破壞了這些相互作用，SmM即處于高活性狀態(tài)。但是上述觀點(diǎn)卻無(wú)法解釋后期通過(guò)重組表達(dá)得到的SmM的結(jié)果，如重組表達(dá)的單頭SmM的活性不受磷酸化調(diào)節(jié)，但其活力比磷酸化后的雙頭SmM活力要低很多。為了對(duì)確定雙頭結(jié)構(gòu)在磷酸化調(diào)節(jié)中的作用，本研究構(gòu)建了一系列不同尾部長(zhǎng)度的SmM截短片段，并且檢測(cè)了它們的結(jié)構(gòu)和受調(diào)節(jié)程度。在確定了對(duì)于形成穩(wěn)定雙頭結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用的尾部序列基礎(chǔ)上，本研究還發(fā)現(xiàn)，在非磷酸化的條件下，actin激活的A

5、TP水解酶活力會(huì)隨著尾部的截短而增加;在磷酸化條件下，actin激活的ATP酶活力會(huì)隨著尾部的截短而降低。尤其重要的是，無(wú)論磷酸化與否，不帶尾部的SmM片段(S1)的活力都遠(yuǎn)低于磷酸化的雙頭SmM，但高于非磷酸化的雙頭SmM。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SmM雙頭結(jié)構(gòu)不但是非磷酸化抑制狀態(tài)所必需的，也是磷酸化激活狀態(tài)所必需的。據(jù)此，本研究提出了SmM磷酸化調(diào)節(jié)的新模型:SmM的默認(rèn)活性狀態(tài)是低活性狀態(tài)，非磷酸化SmM處于抑制狀態(tài)，磷酸化SmM的雙頭

6、間存在協(xié)同作用，處于高活性狀態(tài)。本研究提出的SmM磷酸化調(diào)節(jié)模型可以解釋幾乎所有已發(fā)表的SmM實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　其次，本論文研究了SmM頭尾相互作用在維持非磷酸化抑制狀態(tài)中的作用。大量的研究表明，非磷酸化SmM的頭部和尾部相互作用，但其分子機(jī)制卻不清楚。首先，通過(guò)亮氨酸拉鏈替換的方式鑒定出了對(duì)于維持頭尾作用的關(guān)鍵尾部區(qū)域;其次，通過(guò)點(diǎn)突變以及ATP酶活力測(cè)定的方式進(jìn)一步明確是該尾部區(qū)域的酸性氨基酸參與了與頭部的作用。本論文推測(cè)SmM