牛乳中β-酪蛋白構象性表位定位研究.pdf

1、牛乳是引起食物過敏的八大類常見食物之一。據報道,牛乳過敏引發(fā)的病癥在嬰幼兒中尤為常見,1歲以下嬰幼兒中的發(fā)生率約為2～3％。因此,開展牛乳過敏的研究對于提高牛乳過敏人群生活質量具有重要的的現實意義。另外,由于表位是食物過敏反應的物質基礎,所以表位定位是牛乳過敏研究的一個核心問題,也是人們認識食物過敏的首要任務。
　　 本文以過敏原蛋白質β-酪蛋白為研究對象,從鮮牛乳中分離純化B-酪蛋白、制備特異性多克隆抗體、親和純化多克隆抗體、

2、建立β-酪蛋白構象模型、最終定位出β-酪蛋白的構象性表位,主要的研究工作和結論如下。
　　 1.采用等電點沉淀法從鮮牛乳中得到酪蛋白,冷凍干燥后的酪蛋白粉末經DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離后,得到了β-酪蛋白。經過SDS-PAGE電泳和等電聚焦電泳鑒定,結果表明,獲得了純度高于90％的β-酪蛋白。
　　 2.采用分離純化的β-酪蛋白免疫日本大白耳兔,制備兔抗牛乳β-酪蛋白多克隆抗體,免疫

3、過程中利用間接ELISA方法監(jiān)測免疫效價的變化,最終得到效價分別為1:240,000和1:150,000的抗血清各一份。
　　 3.利用溴化氰活化的Sepharose4B對抗β-酪蛋白兔血清進行親和純化,經SDS-PAGE電泳檢測,結果顯示純化后抗體在泳道中基本上只顯示出重鏈(55Kda)和輕鏈(22Kda)2條帶,純化效果較好；同時對純化后抗體進行間接ELISA效價測定,A、B兩兔的血清效價分別從親和純化上樣前的100,000

4、和70,000上升到純化后的120,000和80,000,表明經過親和純化,得到了高純度和高特異性的多克隆抗體。
　　 4.分別利用同源建模、折疊識別法建模、從頭預測方法對β-酪蛋白結構模型進行構建,并對所建模型進行逐級開放式優(yōu)化和Ramanchandran plot、WHAT CHECK、ERRAT等方法評估,選擇最優(yōu)模型,結果得到經同源建模并經過優(yōu)化后的模型為最終的β-酪蛋白結構模型；以文獻報道的針對β-酪蛋白空間構象的實驗

5、數據作為參照,將所建模型與Kumosinski等人的β-酪蛋白典型模型進行比較,評價本研究工作中建模結果的準確性,結果顯示,與Kumosinski等人所建模型相比,本實驗所建模型更能與β-酪蛋白空間構象的實驗數據吻合。
　　 5.通過噬菌體肽庫篩選得到了用于β-酪蛋白構象性表位定位的6個模擬肽；同時通過搜索得到晶體結構已解析的抗原抗體的復合物,并提取其中的表位信息,形成數據信息庫,然后對該庫進行統(tǒng)計分析,得到表位覆蓋面積大小、表