利用體細胞核移植技術生產轉基因絨山羊的研究.pdf

1、絨山羊體細胞核移植技術的研究目前處于剛剛起步階段。本實驗初步建立了轉基因絨山羊克隆技術體系，并探討了不同類型細胞對絨山羊克隆效率的影響，同時對轉基因絨山羊進行了初步的鑒定以及生產性能檢測。
　　1.絨山羊體細胞核移植技術的建立:
　　成功體外培養(yǎng)并且保存了四個胎兒來源的絨山羊胎兒成纖維細胞（caprinefetalfibroblastcells，CFC）以及兩個成體耳尖成纖維細胞（caprineearfibroblastce

2、lls，CEFC），并通過SRY-PCR方法鑒定了CFCs的性別。使用本實驗室構建成功的真核表達載體通過脂質體轉染CFC，經G418篩選獲得了多個CFCs轉基因細胞系(transgeniccaprinefetalfibroblastcells，TCFC)。TCFC高效表達外源標記基因紅色熒光蛋白，且生長里旺盛，經PCR鑒定外源目的基因已經穩(wěn)定整合入TCFC基因組中。
　　在檢測轉基因克隆胚胎發(fā)育能力時，絨山羊卵母細胞成熟率為72.

3、6％(420/578)，通過體細胞核移植獲得重構胚胎419枚，卵裂率為86.1％(361/419)，囊胚率為14.8％(62/419)，克隆胚胎卵裂較為均勻并且高效表達紅色熒光蛋白。2009年秋季進行了大規(guī)模的胚胎移植實驗，共采集卵細胞6732枚，成熟率為65.1(4380/6732)，融合處理重構胚胎3568枚，融合率為62.8％(2241/3568)，卵裂率為54.9(1231/2241)，移植胚胎924枚，移植受體273只（次），

4、獲得轉基因及體細胞克隆動物20只。
　　2.供體細胞類型和受體羊條件對絨山羊體細胞核移植效率的影響:
　　本實驗主要以不同種類成纖維細胞為核供體研究細胞類型以及受體山羊排卵數(shù)對絨山羊體細胞核移植效率的影響。分別使用不同個體來源胎兒成纖維細胞（CaprineFetalFibroblastCellsCFC）、耳尖成纖維細胞（CaprineEarFibroblastCells，CEFC）、轉基因胎兒成纖維細胞（CaprineFet

5、alFibroblastCells，TCFC）為核供體進行核移植操作，比較成纖維細胞來源、類型、轉基因與否以及性別對融合率、卵裂率、出生率、出生后存活率以及死亡率的影響。共獲得4943枚重構胚胎，其中融合3949枚，體外培養(yǎng)3737枚，共卵裂3094枚，1873枚形態(tài)較好的克隆胚胎進行了胚胎移植實驗，共移植受體羊368只，出生48只，存活35只。不同類型與來源供體細胞其克隆效率不盡相同，其中胎兒成纖維細胞來源胚胎其克隆效率高于耳尖成纖維

6、細胞來源胚胎，非轉基因克隆胚胎效率高于轉基因克隆胚胎，雄性細胞來源胚胎克隆效率高于雌性細胞來源胚胎，表明供體細胞的類型是決定克隆效率的重要因素之一。
　　克隆胚胎的卵裂率與羔羊出生率以及出生后存活率具有正相關性，并且早期克隆胚胎的發(fā)育能力與體細胞核移植效率具有一定的相關性。在分析不同年份克隆效率的波動時，發(fā)現(xiàn)受體母羊排卵點的多少也影響了克隆胚胎的移植受胎率。
　　3.轉基因克隆絨山羊的鑒定與生產性能檢測:
　　分別統(tǒng)計

7、并分析了不同細胞來源的克隆羔羊妊娠天數(shù)與初生重的區(qū)別，并對轉基因羔羊進行初步鑒定，檢測分析了轉基因克隆絨山羊的生產性能。結果表明不同細胞系來源的羔羊其妊娠天數(shù)也不盡相同，TCFC4細胞來源的克隆羔羊妊娠天數(shù)最長為平均157.5天，普通體細胞克隆羔羊妊娠天數(shù)最短只有152.3天。即使相同細胞系來源的克隆羔羊妊娠天數(shù)與出生重也不盡相同，尤其是在轉基因細胞系來源的羔羊中存在較大的波動。
　　所有個體經PCR檢測發(fā)現(xiàn)，外源目的基因IC片段