西瓜枯萎病菌侵染西瓜根系的組織病理學(xué)觀察及致病相關(guān)基因Fove1的功能研究.pdf

1、由尖孢鐮孢菌西瓜?；鸵鸬奈鞴峡菸∈俏鞴仙a(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病害之一。為進(jìn)一步研究其致病機(jī)理，本研究以西瓜枯萎病菌FO1022為受體菌株，優(yōu)化了其原生質(zhì)體的制備條件，通過PEG介導(dǎo)進(jìn)行了hph和gus基因的共轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性以及轉(zhuǎn)化子中g(shù)us基因表達(dá)活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:以0.8 mol/L的NaC1為滲透壓穩(wěn)定劑，10 mg/mL溶壁酶酶解3小時(shí)可以釋放出2.48×108個(gè)/mL原生質(zhì)體，兩個(gè)基因共轉(zhuǎn)入受體菌株的效率

2、為40％以上。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行g(shù)us基因PCR檢測(cè)和活性表達(dá)檢測(cè)表明該基因已轉(zhuǎn)進(jìn)西瓜枯萎病菌基因組中，并能在轉(zhuǎn)化菌株中表達(dá)。在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)7代后，所有轉(zhuǎn)化子仍能穩(wěn)定表達(dá)gus活性。接種西瓜植株后，通過染色觀察可以清晰的觀察到轉(zhuǎn)化子對(duì)不同抗性水平西瓜品種的侵染差異。
　　利用蘸根接種法鑒定西瓜枯萎病菌FO1022生理小種類型，并用綠色熒光蛋白(GFP)基因標(biāo)記該菌株，觀察病原菌侵染西瓜根莖系的組織學(xué)過程。結(jié)果表明，該菌株為西瓜

3、枯萎病菌生理小種1號(hào)。用GFP標(biāo)記的病菌接種感病西瓜品種‘蘇蜜1號(hào)’，接種后2天，顯微觀察顯示病原菌的分生孢子附著于西瓜根系表皮細(xì)胞并萌發(fā)，沿細(xì)胞間層定殖生長(zhǎng);接種后5天，在西瓜根部維管束導(dǎo)管中觀察到大量菌絲和大型分生孢子，在根部表皮細(xì)胞上觀察到大量厚垣孢子，在莖部部分維管束導(dǎo)管中也觀察到少量的菌絲，此時(shí)48.6％的幼苗表現(xiàn)萎蔫癥狀;接種后9天，莖部所有維管束導(dǎo)管都充斥著密集的菌絲體，此時(shí)91.7％的幼苗表現(xiàn)枯萎和死亡。與侵染感病品種相

4、比，該菌株在侵染中抗品種和高抗品種時(shí)，在侵染時(shí)間上要明顯滯后。
　　利用融合PCR制備Fove1基因的同源重組片段，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將Fove1基因的同源重組片段轉(zhuǎn)入西瓜枯萎病菌FO1022菌株中，得到Fove1基因的敲除突變體△Fove1和回復(fù)突變體△Fove1+Fove1，通過對(duì)FO1022、△Fove1和△Fove1+Fove1三個(gè)菌株進(jìn)行菌落、菌絲和分生孢子形態(tài)以及致病力與次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量進(jìn)行比較研究了Fov