苜蓿中華根瘤菌耐鹽分子機(jī)制的研究.pdf

1、苜蓿中華根瘤菌042BM分離自新疆的和田苜蓿，能夠在含0.6mol/LNaCl的FY基本培養(yǎng)基中生長。通過構(gòu)建Tn5-1063插入突變體庫，從20,000多株突變株中得到8株鹽敏感突變株W2、W4、W8、W10、W11、W15、W19和E4。耐鹽性試驗(yàn)表明，它們都不能在含有0.4mol/LNaCl的FY培養(yǎng)基中生長，在0.3mol/LLiCl的FY培養(yǎng)基中不能生長；其中，W15在含有0.1mol/LLiCl的FY培養(yǎng)基上不能生長；W8,

2、W10在含有0.2mol/LLiCl的FY培養(yǎng)基上不能生長。除W4外，其余突變株在相同滲透壓下，對葡萄糖所造成的滲透壓不敏感，只對鹽造成的滲透壓敏感，進(jìn)一步證明它們是鹽敏感而非滲透壓敏感，同時對溫度和pH的耐受性沒有改變。以轉(zhuǎn)座子內(nèi)的基因luxAB為探針進(jìn)行Southern雜交，發(fā)現(xiàn)Tn5在這8個突變株中都只有單一拷貝的插入，表明突變株的鹽敏感表型是由于轉(zhuǎn)座子插入誘變造成的。根據(jù)W11測序結(jié)果，PCR克隆了relA基因ORF，克隆到表達(dá)

3、載體pET-28a，并轉(zhuǎn)入E.coli的relA突變株中，實(shí)驗(yàn)表明，該基因有效地恢復(fù)了E.coli的relA突變株在選擇性培養(yǎng)基上的生長，而空載體的對照則無法生長，從而有力地證明了relA基因的功能。同時，結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)表明，relA基因的突變導(dǎo)致了042BM的結(jié)瘤缺陷。PCR擴(kuò)增得到包含啟動子的relA基因全長，將其克隆至穿梭載體pBBR1MCS-5上。三親本雜交將完整的relA基因轉(zhuǎn)入突變株W11中，使突變株恢復(fù)耐鹽性，進(jìn)一步表明relA