多枝賴草（Leymus multicaulis）鹽脅迫應答相關(guān)基因的克隆及表達分析.pdf

1、多枝賴草(Leymusmulticaulis〈Kar1&Kir1〉Tzvel1，2n=4X=28，XmXmNsNs)屬于小麥近緣屬賴草屬，分布于歐亞地區(qū)不同的生態(tài)環(huán)境下，我國主要分布于新疆地區(qū)，生長于平原綠洲和鹽漬化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐鹽堿性、耐寒性等特性。開展多枝賴草抗逆分子生物學研究，分離耐鹽相關(guān)基因，對于農(nóng)作物的耐鹽育種具有重要意義。本研究以鹽脅迫下的多枝賴草葉片為材料，改良了多枝賴草葉片總RNA提取方法，建立了適合多枝

2、賴草的mRNA差異顯示體系，分離與分析耐鹽相關(guān)基因eDNA序列，克隆谷胱甘肽還原酶基因。結(jié)果如下： 采用四種方法提取多枝賴草葉片總RNA(異硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL試劑快速提取法)，結(jié)果表明：TRIZOL提取法提取的RNA產(chǎn)量較低，電泳呈現(xiàn)出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三條清晰的條帶，A260/A280為1.845，A260/A230為2.091，表明RNA的純度很高。而另外三種方法獲得的R

3、NA純度低，有降解現(xiàn)象。用TRIZOL法提取的RNA作為模板，可以擴增出組成型Actin基因片段，表明提取的多枝賴草葉片總RNA能夠滿足分子生物學研究需要。 通過對退火溫度、模板用量、Taq酶和Mg2+濃度的優(yōu)化，建立了適合多枝賴草基因差異顯示的DDRT-PCR體系。選用26個隨機引物，分別與3個錨定引物組合成引物對，進行鹽脅迫下多枝賴草mRNA差異顯示，獲得17個長度在300～600bp的差異cDNA條帶，進行序列測定及分析。

4、反Northern雜交分析篩選出11個陽性片段。 GenBank/BLAST分析，DNA片段1編碼的蛋白與腺苷酸結(jié)合蛋白有29％的相似，這與DNA的表達調(diào)節(jié)有關(guān)；cDNA片段2編碼的蛋白質(zhì)與與UMP/CMPkinase42％相似，UMP/CMPkinase與核苷酸的磷酸化有關(guān)，在信號傳導方面起作用；cDNA片段4編碼的蛋白質(zhì)與S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各種水分脅迫的主要傷害方式；可能與植物

5、的活性氧清除有關(guān)；該片段與GenBank中干旱脅迫二色高粱cDNA文庫一片段的核苷酸序列有99％的相似性，說明該基因可能與水分逆境脅迫可能有較為密切的關(guān)系；cDNA5和10編碼的蛋白與轉(zhuǎn)錄修復因子35％的相似，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)；DNA片段6編碼的蛋白與嗅感覺蛋白有21％的相似；cDNA片段11編碼的蛋白質(zhì)與來源于玉米的過氧化氫酶(catalase，EC1.11.1.6)34％一致，過氧化氫酶與鹽脅迫下過氧化傷害的清除有密切關(guān)系；cDNA13編

6、碼的蛋白質(zhì)與小麥鋁誘導蛋白wali3有60％的相似性；DNA片段14編碼的是一新的蛋白，在GenBank中無相似蛋白存在；DNA片段15編碼的蛋白與一個小結(jié)構(gòu)蛋白相似；cDNA片段17與β-香樹素合成酶基因53％相似，該酶是次生代謝物合成過程的一個酶。定量PCR表明DNA片段4和11與植物的耐鹽性有一定的相關(guān)性。 谷胱甘肽還原酶是植物體內(nèi)一類重要的抗氧化酶。以多枝賴草葉片為材料，根據(jù)植物谷胱甘肽還原酶(GR)氨基酸保守區(qū)序列設計

7、簡并引物，通過RT-PCR擴增到1個408bp大小的cDNA片段(Genbank注冊號為AY781786)，5'RACE和3'RACE克隆獲得5'和3'端序列，拼接得cDNA基因全長包含1580bp，包含一個1140bp的開放閱讀框架，編碼380個氨基酸。與水稻、玉米、煙草、葡萄、白菜、擬南芥大豆等植物谷胱甘肽還原酶氨基酸序列的同源性在77～92％之間。Southern印跡雜交表明多枝賴草谷胱甘肽還原酶基因在基因組中以單拷貝存在。

8、 Northern雜交和定量PCR分析多枝賴草GR基因在鹽脅迫下的表達，隨著鹽脅迫濃度的增加，GR基因表達加強，150mmol/L和300mmol/L處理時增加顯著。150mmol/LNaCl鹽脅迫下不同時間處理表明，GR基因隨脅迫時間的延長而表達加強；處理24h時，GR基因表達水平最高。ABA(100mol/L)和干旱處理，GR基因也表現(xiàn)出與鹽處理相似的上調(diào)效應，兩種實驗方法研究多枝賴草GR基因在脅迫下的表達，可以得到一致的結(jié)果，G