星星草耐鹽分子機(jī)理研究及相關(guān)基因的克隆.pdf

1、星星草是一種有較強(qiáng)耐鹽堿能力的鹽生植物，是進(jìn)行植物耐鹽堿機(jī)理研究的理想材料。為研究NaHCO3脅迫下星星草的耐鹽機(jī)理，以450mmol/LNaHCO3脅迫處理的星星草葉片為材料構(gòu)建了cDNA文庫，同時，用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析和cDNA表達(dá)譜芯片分析相結(jié)合的方法研究了NaHCO3和干旱脅迫下星星草基因的表達(dá)。 所構(gòu)建cDNA初始文庫的滴度為1.0×106pfu/mL，文庫的重組率為95％，PCR檢測顯示，插入片段的平均長度為

2、0.8kb。從文庫中隨機(jī)挑選3168個克隆進(jìn)行測序，共獲得2972條高質(zhì)量的序列；通過序列的聚類分析共將1102條序列拼接為496個contig，其余1870條序列為單一序列，共獲得2366條無重復(fù)的獨(dú)立序列，它們的GenBank登錄號為CN485355～CN487720。 從2366條序列中挑選660個cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后作靶基因點(diǎn)樣在玻片上制成cDNA芯片。將對照、NaHCO3和干旱處理的星星草總RNA，經(jīng)熒光染料Cy5-

3、dCTP和Cy3-dCTP標(biāo)記后制成cDNA探針，與cDNA芯片進(jìn)行雜交。 2366個序列的BLASTX分析結(jié)果顯示，共有1274條序列與已知基因序列高度同源，618條為與已知基因同源性較低，其余474條序列與已知基因無任何同源性。將1274條與已知基因同源的序列按功能分為12類，其中代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、功能未知及細(xì)胞防御相關(guān)四類基因的表達(dá)豐度最高，分別占已分類EST總數(shù)的18.84％、12.48％、¨.22％和9.66％。對高豐度

4、表達(dá)基因和162條可能與耐鹽相關(guān)基因的分析表明，光合作用、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞防御4類基因的表達(dá)豐度較高，說明光合作用、水分和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、耐鹽基因的表達(dá)調(diào)控、活性氧等毒性物質(zhì)的去除等過程在星星草抗鹽脅迫時起到了重要作用。cDNA芯片研究NaHCO3脅迫下星星草基因表達(dá)結(jié)果顯示，共有25個基因在鹽脅迫處理前后差異表達(dá)，其中17個基因在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)，8個基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，這些基因的功能主要涉及了信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞防御、細(xì)

5、胞代謝3個方面，這些差異表達(dá)的基因可能在星星草抗鹽過程中具有重要作用。cDNA芯片研究干旱脅迫下星星草基因表達(dá)，共發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因24個，上調(diào)表達(dá)基因18個。差異表達(dá)基因的功能主要涉及了信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、逆境響應(yīng)等方面。通過以上研究，初步建立了NaHCO3、干旱脅迫前后星星草基因的表達(dá)譜。 植物的抗鹽過程是一個復(fù)雜的多基因協(xié)同作用的體系。以上研究說明，通過EST技術(shù)和cDNA芯片分析等基因組學(xué)研究手段的應(yīng)用，可有效獲取鹽脅迫