嗜熱菌糖苷酶基因LacS牛乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定.pdf

1、利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物活性蛋白，是當(dāng)前生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵在于構(gòu)建合理、表達(dá)效率高、特異性好的真核表達(dá)載體，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的酪蛋白是牛乳中一個主要的蛋白成分。
　　該研究中，以牛酪蛋白基因的上游調(diào)控成分作為啟動子，嗜熱菌糖苷酶基因lacS為目的基因，構(gòu)建了一個乳腺特異性表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)重構(gòu)載體轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞和蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞，對轉(zhuǎn)基因的奶牛乳腺上皮細(xì)胞做 DNA、RNA及蛋白水平的鑒定

2、。對轉(zhuǎn)基因蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞做DNA水平鑒定。
　　首先，通過PCR技術(shù)分別從不同模板上擴(kuò)增出CMV啟動子、poly(A)加尾序列、lacS基因序列、BC啟動子等部分，依次將上述序列與pDsRed2-1質(zhì)粒相連接，利用CMV啟動子指導(dǎo)紅色熒光蛋白基因表達(dá)，便于篩選陽性克??；BC啟動子指導(dǎo)目的基因lacS在奶牛乳腺進(jìn)行特異性表達(dá)；從而構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pBL。
　　其次，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)重構(gòu)載體轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并從D

3、NA、RNA及蛋白水平進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞，做形態(tài)學(xué)分析，生長曲線測定、核型分析、性別鑒定及G418最小致死濃度測定。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)重構(gòu)載體轉(zhuǎn)染蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞，并做DNA鑒定，為后續(xù)核移植實(shí)驗(yàn)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物提供體細(xì)胞。
　　結(jié)果表明：奶牛乳腺上皮細(xì)胞G418最小致死濃度為700μg/ml，在DNA、RNA及蛋白水平上能夠檢測到目的基因的表達(dá)。蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞G418最小致死濃度為700μg/ml。在DNA