GS Rb1與IA對缺血缺氧心肌細胞的作用及機理探究.pdf

1、目的:
　　1.通過培養(yǎng)乳鼠原代心肌細胞建立缺血缺氧模型，觀察心肌細胞在缺血缺氧環(huán)境細胞損傷、凋亡與能量代謝變化情況。
　　2.觀察益氣活血中藥人參及毛冬青的主要有效成分人參皂苷Rb1(GS Rb1)及毛冬青甲素(IA)對缺血缺氧心肌細胞損傷及凋亡的影響，探討GS Rb1與IA對缺血缺氧心肌細胞的保護作用。
　　3.初步探索缺血缺氧心肌細胞中能量代謝AMPK-PGC-1α通路表達及腺苷酸生成情況，初步探討人參皂苷Rb1

2、(GS Rb1)與毛冬青甲素(IA)干預缺血缺氧心肌細胞的能量代謝途徑，了解其對缺血缺氧心肌細胞的保護作用機制，為益氣活血法用于心力衰竭的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.原代心肌細胞缺血缺氧模型的建立:
　　選取新生SD乳鼠采集心肌組織消化成心肌細胞的單細胞懸液，正常培養(yǎng)72h后利用缺血培養(yǎng)液及物理缺氧方法分別對心肌細胞進行缺血缺氧30min、1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h造模干預。通過氧氣含量指

3、示劑確認缺氧水平，利用CCK8法檢測細胞活力，光鏡、電鏡觀察細胞損傷情況，建立缺血缺氧心肌細胞模型。
　　2.GS Rb1與IA對缺血缺氧心肌細胞及線粒體的保護作用研究:
　　正常培養(yǎng)乳鼠心肌細胞48h后將細胞分為11組:正常組、模型組、曲美他嗪組、參高組、參低組、毛高組、毛低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組、參低毛低組。正常組與模型組繼續(xù)完全培養(yǎng)液正常放置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，給藥組分別置換添加相應濃度藥液的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2

4、4h，共培養(yǎng)72h。利用缺血缺氧造模方法對模型組及各給藥組進行缺血缺氧造模干預6h，正常組繼續(xù)正常培養(yǎng)6h。78h收集細胞進行檢測。利用CCK8檢測細胞活力、比色法檢測LDH、FFA、MDA水平、倒置顯微鏡、電鏡觀察細胞損傷情況、TUNEL法檢測細胞凋亡率、流式細胞儀檢測mPTP開放情況。
　　3.GS Rb1與IA干預缺血缺氧心肌細胞能量代謝的機制研究:
　　首先探討心肌細胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝相關代謝變化情況。將細胞

5、分為2組:正常組、模型組。利用前述實驗方法對乳鼠心肌細胞進行培養(yǎng)造模及藥物干預，利用western blot檢測能量底物代謝相關蛋白AMPK、PGC-1a、PPARa、GLUT4、CPT-1、ACADM和線粒體生成相關蛋白Tfam、NRF2蛋白表達水平。探究人參皂苷Rb1與毛冬青甲素干預后缺血缺氧心肌細胞上述能量代謝相關蛋白的表達情況，探討兩藥干預缺血缺氧心肌細胞能量代謝的相關機制。將細胞分為10組，分別為模型組、曲美他嗪組、參高組、參

6、低組、毛高組、毛低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組、參低毛低組。利用westernblot檢測上述能量代謝相關蛋白表達情況。高效液相色譜法檢測腺苷酸AMP、ADP、ATP含量。
　　結果:
　　1.原代心肌細胞缺血缺氧模型的建立:
　　通過氧氣含量指示劑確認在缺氧盒內心肌細胞達到缺氧要求。通過CCK8檢測細胞活性曲線和光鏡、電鏡觀察心肌細胞在缺血缺氧環(huán)境中各個時間節(jié)點形態(tài)學的改變，選取6h為缺氧造模時間點。模型組

7、與正常組心肌細胞比較具有明顯細胞損傷的形態(tài)學改變，搏動力顯著下降，細胞活力明顯降低，出現(xiàn)明顯的衰竭心肌細胞表現(xiàn)，缺血缺氧心肌細胞造模成立。
　　2.GS Rb1與IA對缺血缺氧心肌細胞及線粒體的保護作用研究:
　　2.1.光鏡觀察:將心肌細胞進行分組給藥后，倒置顯微鏡下可觀察到缺血缺氧模型組心肌細胞出現(xiàn)明顯細胞損傷表現(xiàn)，心肌搏動力明顯下降，搏動頻率減慢。曲美他嗪組較模型組心肌細胞活力明顯增強，細胞形態(tài)未受明顯影響，細胞搏動力

8、與頻率較正常組稍減，較模型組明顯好轉。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素給藥組細胞形態(tài)與搏動力均較模型組有改善，以人參皂苷Rb1高劑量與毛冬青甲素高劑量聯(lián)用組心肌細胞保護作用最顯著，兩藥劑量與細胞保護效力呈量效關系。
　　2.2.電鏡觀察:通過電鏡下分析各分組給藥心肌細胞形態(tài)與各細胞器、線粒體形態(tài)，人參皂苷Rb1與毛冬青甲素干預組與曲美他嗪組細胞損傷程度較模型組均有不同程度改善，線粒體功能與完整性得到保護，并發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1與毛冬青甲素

9、高劑量聯(lián)用組抗缺血缺氧損傷效用與曲美他嗪作用相似，同時電鏡分析說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素在單藥與聯(lián)用對缺血缺氧心肌細胞的保護作用均存在量效關系，人參皂苷Rb1高劑量與毛冬青甲素高劑量單藥作用相似。
　　2.3.細胞活力檢測:通過CCK8法檢測細胞存活率顯示，模型組與正常組相比細胞存活率明顯減低。模型組與藥物干預組對比，各給藥干預組細胞存活率均有一定程度提高，兩藥聯(lián)用組較單藥組有更高效用，參高毛高組具有最明顯作用，顯著地改善了缺

10、血缺氧心肌細胞的細胞損傷。
　　2.4.細胞損傷相關指標:LDH、FFA、MDA檢測顯示:模型組與空白組對比LDH、FFA、MDA均明顯上升，缺血缺氧后細胞損傷模型建成。各給藥干預組與模型組對比，LDH、FFA、MDA含量均明顯降低。各給藥干預組對減低細胞內LDH、FFA、MDA均有一定作用，作用分別呈量效關系。人參皂苷Rb1高低劑量均能夠明顯降低LDH含量，且呈量效關系。毛冬青甲素高劑量可降低LDH含量。兩藥聯(lián)用組能夠明顯降低L

11、DH，且作用較人參皂苷Rb1與毛冬青甲素單藥明顯，呈量效關系，參高毛高組具有最優(yōu)效用。參高毛高組在降低胞內FFA有最優(yōu)效用（P＜0.01)。在給藥干預組與模型組的對比中，各個給藥組MDA含量與模型組有非常大的差異，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，說明各個給藥組都對缺血缺氧心肌細胞氧化損傷有治療作用。在曲美他嗪組分別與參高組、參低組、參高毛高組、參低毛低組、參低毛高組的兩兩比較中無統(tǒng)計學差異。說明這5組對MDA指示的細胞過氧化損傷與曲美他嗪治

12、療效應相似。
　　2.5.MPTP開放檢測:利用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)對細胞質、線粒體進行染色，再通過氯化鈷與細胞質內鈣黃綠素發(fā)生反應熒光猝滅，分析得線粒體通透性轉移孔mPTP開放情況，從而得到在造模干預情況下細胞線粒體功能狀態(tài)。模型組熒光表達較正常組相比明顯下降，曲美他嗪組與參高毛高組比較相近，說明兩者在抑制線粒體通透性轉移孔開放方面具有相近效用。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素對抑制mPTP開放調控的作用均呈量效關系

13、。各藥物干預組與模型組對比均具有非常顯著的差異，說明各給藥組對缺血缺氧心肌細胞線粒體膜損傷均有改善作用。
　　2.6.細胞凋亡:在TUNEL法檢測細胞凋亡率中，模型組凋亡率與正常組對比明顯上升，說明缺血缺氧造模后對心肌細胞凋亡的影響巨大，能夠明顯地發(fā)揮促凋亡作用。與模型組相比，曲美他嗪組及參高組、參低組、毛高組、人高毛高組、人高毛低組、人低毛高組都均有明顯降低細胞凋亡率的作用，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素聯(lián)用及人身皂苷Rb1與毛

14、冬青甲素單用對抑制細胞凋亡均具有顯著作用。
　　3.GS Rb1與IA干預缺血缺氧心肌細胞能量代謝的機制研究:
　　3.1.能量代謝通路蛋白表達:觀察各分組心肌細胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝相關蛋白表達，模型組AMPK、PPARa、PGC-1a、CPT-1、ACADM、NRF2、Tfam與正常組對比均有不同程度下降，Glut4蛋白表達量在造模后無明顯變化。在給藥后，曲美他嗪組與參高毛高組AMPK表達量明顯高于其余各給藥組，且參

15、高毛高組蛋白表達量高于曲美他嗪組，P＜0.01，結果具統(tǒng)計學意義。本次實驗中未發(fā)現(xiàn)各藥物對PPARa蛋白表達有明顯促進作用。與模型組對比，參高組、參低組與模型組對比能夠明顯提高缺血缺氧心肌細胞PGC-1a蛋白的表達量，兩兩對比P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。參高毛高組、參高毛低組與模型組對比均有明顯差異，都能夠上調PGC-1a蛋白表達量，P＜0.01，結果具有統(tǒng)計學意義。參高組、參低組和參高毛高組、參高毛低、參低毛高、參低毛低組兩兩比

16、較、存在量效關系，P＜0.01，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素聯(lián)用對PGC-1a表達量有明顯促進作用，且與藥物濃度密切相關。曲美他嗪能夠明顯降低缺血缺氧心肌細胞CPT-1蛋白表達，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。與模型組兩兩相比，參高組、毛高組、參高毛高組、參低毛高組對CPT-1蛋白表達有負性作用，P＜0.01，結果具有統(tǒng)計學意義。各給藥組與模型組對比蛋白表達趨勢均有下降，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素無明顯促進脂肪酸代謝作用。除參低

17、毛高組外，各給藥組對ACADM均無明顯促進或抑制作用。曲美他嗪組GLUT4蛋白表達量上可見明顯升高，與模型組對比P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義，說明曲美他嗪能夠顯著地上調GLUT4蛋白表達，促進機體轉運利用葡萄糖進入線粒體氧化功能。與模型組對比，參高組、參低組、毛高組、參高毛高組、參高毛低組與模型組兩兩比較均有明顯促進作用，P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。說明這幾組藥物配比與濃度可明顯增加GLUT4蛋白表達量。參高毛高組與其他藥物干預組兩兩

18、比較p值均＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。參高毛高組在促進GLUT4蛋白表達與葡萄糖代謝中具有最優(yōu)效用。在與模型組的兩兩比較中，各給藥干預組均能夠明顯地上調NRF-2蛋白表達量，P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素對NRF-2蛋白有明顯激活效用，曲美他嗪組與參高組、參低組、毛高組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組兩兩比較結果無統(tǒng)計學意義，該幾組具有相似的促進NRF-2蛋白表達作用。參高毛高組與其余各給藥干預組的對比中P

19、＜0.01，具有統(tǒng)計學意義，說明參高毛高組能夠顯著地促進NRF-2蛋白表達，在各組中具有最優(yōu)效用。與模型組的比較中，各給藥干預組均能夠提高缺血缺氧心肌細胞Tfam蛋白的表達，P＜0.01，且與正常組比較均有明顯的調高現(xiàn)象，考慮與應激性藥物刺激蛋白及線粒體的快速合成有關。在給藥干預組中，參高毛高組與其他各給藥組兩兩比較P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素高劑量配伍給藥具有最優(yōu)效用。
　　3.2.高能磷酸化合物

20、生成:觀察各分組心肌細胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝產物生成情況，模型組與正常組比較AMP含量明顯增加，ADP、ATP含量顯著下降，三者與正常組比較P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義在給藥組與模型組AMP含量的兩兩比較中，各給藥組都在一定程度上降低了缺血缺氧環(huán)境下心肌細胞AMP的含量，P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。在降低AMP含量方面，參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組能夠明顯降低AMP的效用。在給藥組與模型組ADP含量的比較中，發(fā)現(xiàn)各給藥干預組

21、ADP含量均有升高，P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。其中，曲美他嗪組與參高毛高組ADP含量無統(tǒng)計學意義，P＞0.05，說明二者具有相似的升高ADP含量的作用。余組與ADP含量的提高大致呈量效關系。在給藥組與模型組ATP含量的比較中，曲美他嗪組、參高組、參低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組均有明顯提高ATP含量的作用，P＜0.01，結果有統(tǒng)計學意義。毛高組、毛低組、參低毛低組在趨勢上對促進ATP生成有一定表現(xiàn)，但與模型組比較P＞0.0

22、5，無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.心肌細胞缺氧1h起即出現(xiàn)缺氧損傷表現(xiàn)，以缺血缺氧6h為造模條件制備心肌細胞缺血缺氧模型成立。
　　2.人參皂苷Rb1及毛冬青甲素對保護缺血缺氧心肌細胞形態(tài)學完整性、降低凋亡率、減少細胞脂質沉積、減輕脂質過氧化損傷、減少線粒體通透性轉移孔的開放保護線粒體功能等都有明顯作用。單藥組中人參皂苷Rb1對心肌細胞的保護作用總體優(yōu)于毛冬青甲素。
　　3.AMPK-PGC-1a通路可能是

23、調節(jié)缺血缺氧心肌細胞能量代謝的關鍵通路。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素都能夠明顯激活AMPK-PGC-1a通路，刺激葡萄糖代謝與線粒體生成。人參皂苷Rb1能夠降低AMP含量，促進ADP、ATP生成，改善缺血缺氧心肌細胞能量代謝。毛冬青甲素能夠降低AMP含量，促進ADP生成，對ATP生成無明顯作用。
　　4.人參皂苷Rb1與毛冬青甲素高劑量聯(lián)用在保護缺血缺氧心肌細胞形態(tài)學完整性、降低凋亡率、減少細胞脂質沉積、減輕脂質過氧化損傷、減少線粒