三氯生對孕鼠胎盤發(fā)育的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、三氯生(TCS)作為一種非離子型鹵代酚類廣譜抗菌劑廣泛使用于護(hù)膚品、牙膏、臨床護(hù)理清潔液等。181名母親志愿者的尿液和臍帶血液中TCS檢出率分別為100％和51％。母乳中也能檢測到TCS。
　　研究室的前期研究已報(bào)道，孕婦尿液中TCS濃度增加與自然流產(chǎn)的發(fā)生顯示正相關(guān)。用100mg/kg高劑量TCS處理孕第5-18天小鼠能引起胎鼠的體重降低和死亡率增加。我們進(jìn)一步觀察到TCS暴露能引起孕鼠血中四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原

2、氨酸（T3）水平降低。臨床資料顯示，母親的低甲狀腺激素與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩密切相關(guān)。TCS(10mg/kg)暴露引起孕鼠的T4和T3水平降低和胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩。胎盤是母胎間交換物質(zhì)的器官。胎兒的宮內(nèi)發(fā)育依靠胎盤從母體攝得營養(yǎng)，而產(chǎn)生的廢物經(jīng)過胎盤排出。胎盤的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與胎盤的發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能活性有關(guān)。有研究證明，滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)T3和T4受體，甲狀腺激素通過激活PI3K-Akt-mTOR和ERK信號通路

3、能刺激滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和促進(jìn)胎盤生長發(fā)育。此外，甲狀腺激素也可以調(diào)節(jié)胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SNAT1、SNAT2、SNAT4、TAUT)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT1、GLUT3)的表達(dá)和功能活性。由此推測，孕鼠TCS暴露有可能通過降低T3和T4水平影響胎盤的發(fā)育和功能，從而導(dǎo)致胎鼠的宮內(nèi)發(fā)育遲緩。
　　研究目的:闡明TCS暴露對孕鼠胎盤發(fā)育的影響及其甲狀腺激素介導(dǎo)的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.孕第6-18天I

4、CR小鼠進(jìn)行1，4，8mg/kg/day劑量的TCS灌胃。以下簡稱1-TCS孕鼠、4-TCS孕鼠和8-TCS孕鼠。
　　2.胎盤用4％多聚甲醛固定和石蠟包埋。5μm切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，計(jì)算胎盤和迷路的體積。
　　3.用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射，3小時(shí)后取出胎盤固定，石蠟包埋，進(jìn)行BrdU和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫染色，進(jìn)行BrdU陽性(BrdU+)和PCNA陽性(PCNA+)細(xì)胞計(jì)數(shù)

5、。
　　4.放射示蹤法標(biāo)記(14C-MeAIB，14C-Glucose)測量胎盤氨基酸和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
　　5.用酶聯(lián)免疫法檢測血清T4、T3、促甲狀腺激素(TSH)，雌激素(E2)和孕酮(P4)，胎盤的白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)。
　　6.用蛋白印跡法(Western blot)檢測Akt、mTOR、p70S6K、ERK1/2蛋白和磷酸、TNF-α蛋白。
　　7.實(shí)時(shí)定量PCR檢測胎盤P

6、CNA、Cyclin D3、SNAT1、SNAT2、SNAT4、TAUT、 GLUT1、 GLUT3。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.在妊娠第6-18天的8-TCS孕鼠，胎鼠的體重和存活率降低，而1-TCS孕鼠或4-TCS孕鼠沒有發(fā)生胎鼠體重和存活率的改變。
　　2.在妊娠第19天的8-TCS孕鼠，胎盤的重量減輕、總體積和迷路區(qū)體積減小，但是未出現(xiàn)胎盤血栓和組織壞死。同樣，1-TCS孕鼠或4-TCS孕鼠也沒有出現(xiàn)胎盤生長和發(fā)

7、育的障礙。
　　3.在妊娠第13天的8-TCS孕鼠，胎盤BrdU+細(xì)胞和PCNA+細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照孕鼠;PCNA和Cyclin D3 mRNA水平也明顯降低，提示TCS抑制胎盤的細(xì)胞增殖。
　　4.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠，14C-MeAIB和14C-Glucose在單位重量胎盤的水平明顯低于對照孕鼠，但是單位重量胎兒體內(nèi)的相對水平?jīng)]有明顯改變，提示 TCS能破壞胎盤的營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、氨基酸）轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　5

8、.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠，無論胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SNAT1和SNAT4的表達(dá)水平或者葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1都低于對照孕鼠，但是GLUT3和SNAT2表達(dá)無明顯改變。
　　6.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠，T3和T4的血清水平都低于對照孕鼠，伴有TSH水平增加，但是E2和P4水平?jīng)]有明顯改變。
　　7.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠，胎盤Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平明顯降低，而ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有異

9、常。對妊娠第15-17天8-TCS孕鼠進(jìn)行L-T4(5mg/kg)處理能提高胎盤Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平，提示TCS誘導(dǎo)的低甲狀腺激素可以抑制Akt-mTOR-p70S6K信號通路。
　　8.對妊娠第10-13天8-TCS孕鼠進(jìn)行L-T4處理能增加胎盤Brdu+細(xì)胞和PCNA+細(xì)胞數(shù)量。對妊娠第15-17天TCS-孕鼠進(jìn)行L-T4處理能改善14C-MeAIB和14C-Glucose通過胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，增加存活胎鼠