穩(wěn)定表達熒光素酶的重組HBV復(fù)制細胞系及HBV易感細胞系的構(gòu)建.pdf

1、HBV引起的慢性乙型病毒性肝炎及其相關(guān)疾病嚴(yán)重危害人類健康。HBV持續(xù)感染是發(fā)展成肝硬化、肝癌的重要危險因素。加強對HBV分子生物學(xué)的研究，為指導(dǎo)臨床治療和新藥的發(fā)現(xiàn)提供重要的依據(jù)，同時將有助于降低HBV的發(fā)病率和死亡率。
　　本研究中，我們通過構(gòu)建穩(wěn)定表達熒光素酶的重組HBV復(fù)制細胞系及HBV易感細胞系，為HBV感染模型的研究及受體抑制劑的研究提供了有利工具。
　　第一部分：穩(wěn)定表達熒光素酶的重組HBV復(fù)制細胞系的構(gòu)建

2、r>　　目的：將乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）改造成可以攜帶表達熒光素酶標(biāo)簽的重組HBV，并且在輔助質(zhì)粒存在時仍有復(fù)制能力并能形成完整的HBV顆粒。
　　方法：
　　1.應(yīng)用PCR及分子克隆技術(shù)，利用表達野生型HBV的pTRE-HBV質(zhì)粒，在HBV S區(qū)HBsAg的XhoI-BsrGI區(qū)段表達熒光素酶secNluc，構(gòu)建帶有SecNluc熒光素酶標(biāo)簽的pTRE-HBV-S-NLuc的重組HBV質(zhì)粒

3、。
　　2.構(gòu)建具有殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142。
　　3.表達潮霉素抗性的重組HBV質(zhì)粒pTRE-HBV-S-NLuc與表達殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142以1:1的比例共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2-TA2-7細胞。經(jīng)新霉素、潮霉素和殺稻瘟菌素共同加壓篩選穩(wěn)定表達熒光素酶的HBV復(fù)制細胞克隆。
　　4.通過熒光定量PCR檢測技術(shù)檢測各個

4、細胞克隆上清液中的HBV DNA表達水平；同時，利用Nano-Glo Luciferase Assay System試劑盒檢測這些細胞克隆上清液中熒光素酶量的表達水平。篩選出HBV DNA表達水平以及熒光素酶表達水平均較高的細胞克隆進行進一步的相應(yīng)檢測。
　　5.通過Native Western Blot檢測篩選出的細胞克隆的HBV核心蛋白顆粒的形成。
　　6.通過Southern blot檢測篩選出的細胞克隆中HBV DN

5、A的形成。
　　7.通過透射電鏡觀察細胞內(nèi)病毒顆粒的形成。
　　結(jié)果：
　　1.表達潮霉素抗性的重組HBV質(zhì)粒pTRE-HBV-S-NLuc與表達殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142以1:1的比例共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2-TA2-7細胞，經(jīng)新霉素、潮霉素和殺稻瘟菌素三種抗生素共同加壓篩選，挑選36個細胞克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)，分別編號HBV-SNLuc1～36，并應(yīng)用熒光定量 PCR方法

6、和Nano-Glo Luciferase Assay System試劑盒分別檢測了各個細胞克隆上清液中的HBV DNA表達水平以及熒光素酶的表達水平。經(jīng)過分析比較，最終篩選出HBV DNA表達水平及熒光素酶的表達量均較高的6個細胞克隆進一步分析，分別為HBV-SNLuc-(1,12,13,24,35,36)。
　　2.經(jīng)Native Western Blot檢測，可觀察到6個細胞克隆以及HepG2.117細胞均有核心蛋白顆粒形成，

7、結(jié)果證實HBV-SNluc細胞可以產(chǎn)生完整的核心蛋白顆粒。
　　3.經(jīng)Southern blot檢測，可觀察到6個細胞克隆以及HepG2.117細胞均有疏松環(huán)狀、雙鏈及單鏈HBV DNA的形成，結(jié)果證實HBV-SNluc細胞能夠產(chǎn)生HBV的復(fù)制中間體，并有較強的復(fù)制能力。
　　4.經(jīng)過上述檢測，確定HBV-SNLuc-35為最佳細胞株，不僅分泌較高的HBV顆粒，也表達較高水平的熒光素酶。
　　5.通過透射電鏡觀察，可以

8、看到HBV-SNLuc-35細胞克隆能夠產(chǎn)生與對照組HepG2.117細胞相似的病毒顆粒。
　　結(jié)論：利用HepG2細胞成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達熒光素酶的并具有HBV復(fù)制的細胞克隆，經(jīng)系列研究，篩選出一株高效表達熒光素酶和分泌重組HBV顆粒的細胞系HBV-SNLuc-35。
　　第二部分：QSG-7701細胞穩(wěn)定表達NTCP制備HBV易感細胞系的研究
　　目的：鑒于QSG-7701細胞能夠更好的支持HBV的復(fù)制，本研究應(yīng)用Q

9、SG-7701細胞構(gòu)建穩(wěn)定表達鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽（sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP）的QSG-7701的HBV易感細胞模型。
　　方法：
　　1.在含有白蛋白啟動子的質(zhì)粒pAlb上表達帶有Flag標(biāo)簽的NTCP基因，再插入一個潮霉素抗性基因表達盒，最終構(gòu)建了潮霉素抗性的以白蛋白啟動子驅(qū)動表達NTCP的質(zhì)粒pAlbHyg-NTCP-Flag。

10、>　　2.表達NTCP的質(zhì)粒pAlbHyg-NTCP-Flag轉(zhuǎn)染肝癌細胞系QSG-7701細胞。經(jīng)潮霉素加壓篩選穩(wěn)定表達NTCP的細胞系QSG-7701NTCP，通過免疫熒光檢測觀察NTCP在細胞膜表面的表達，挑選NTCP表達較強的細胞克隆。
　　3.復(fù)蘇本實驗曾經(jīng)構(gòu)建的穩(wěn)定表達TC-FIAsH熒光標(biāo)記的HBV復(fù)制型細胞系TC-3-1，利用上清中濃縮的重組HBV感染QSG-7701NTCP細胞系以及對照組293T細胞、QSG-7

11、701細胞，經(jīng)過雙砷熒光染料標(biāo)記以及染核標(biāo)記觀察雙砷熒光的分布情況。
　　4.利用表達熒光素酶的重組HBV感染穩(wěn)定表達NTCP的細胞系，通過熒光素酶的檢測，觀察NTCP對HBV的易感性。
　　結(jié)果：
　　1.pAlbHyg-NTCP-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QSG-7701細胞，經(jīng)潮霉素加壓篩選，選擇12個細胞克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)。通過免疫熒光檢測細胞膜上NTCP的表達，篩選出表達量較高的4個細胞克隆，分別命名為QSG-7701N

12、TCP1～4其中QSG-7701NTCP2表達量最高，而未轉(zhuǎn)染NTCP的對照組QSG-7701只能看到微弱的熒光。
　　2.制備TC-FIAsH熒光標(biāo)記的重組HBV，分別感染QSG-7701NTCP2、293T以及QSG-7701細胞系，6小時后通過雙砷熒光染料標(biāo)記以及染核標(biāo)記可以看到 QSG-7701NTCP能夠在細胞膜上有較強的熒光表達， QSG-7701只能觀察到微弱的熒光，而293T細胞未觀察到熒光，證實了HBV與肝細胞膜

13、上NTCP的結(jié)合。
　　3.利用 HBV-SNLuc-35細胞上清中濃縮的病毒感染 QSG-7701NTCP1～4及 QSG-7701細胞系，經(jīng)過熒光素酶的檢測，可以觀察到在QSG-7701NTCP1～4細胞培養(yǎng)上清液中熒光素酶的表達水平從第4天開始升高，并持續(xù)4-5天，均高于在QSG-7701細胞系中的表達，其中QSG-7701NTCP4最高，從而證實了QSG-7701NTCP細胞系對HBV的易感性。
　　結(jié)論：通過QSG