瑪氏骨條藻在不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜特征分析.pdf

1、赤潮是一種異常生態(tài)現(xiàn)象，赤潮的發(fā)生對(duì)于海洋生態(tài)環(huán)境、漁業(yè)生產(chǎn)、旅游業(yè)乃至人類身體健康都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。最近一二十年來，赤潮發(fā)生的頻率不斷增加，范圍不斷加大，產(chǎn)生的危害也不斷加劇，因此，赤潮已成為全球海洋科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。有關(guān)赤潮的研究已經(jīng)取得了大量的成果，但是作為一種重要的赤潮藻，目前對(duì)瑪氏骨條藻的研究仍然比較有限，尤其是缺乏基因組信息，對(duì)其爆發(fā)和消亡的分子機(jī)制缺乏系統(tǒng)深入的研究。本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)瑪氏骨條藻

2、不同生長(zhǎng)期（指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期）和低溫脅迫、高溫脅迫、低硅脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，并開展了數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)特征分析。通過全面、系統(tǒng)地了解瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組特征，探索不同生長(zhǎng)期的表達(dá)譜差異，深入分析瑪氏骨條藻響應(yīng)低溫、高溫和低硅環(huán)境脅迫的分子機(jī)制，為研究瑪氏骨條藻赤潮爆發(fā)的分子機(jī)制提供新認(rèn)識(shí)。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同脅迫處理的瑪氏骨條藻混合

3、RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得117，184，612條干凈的短讀長(zhǎng)序列(clean reads)，堿基總量約為11.7G，拼接后得到20，319條平均長(zhǎng)度為1，602bp的非重復(fù)序列基因(unigenes)。通過篩查序列中可能存在的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了3，220個(gè)潛在的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)位點(diǎn)、171，260個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)以及9，464個(gè)插入缺失(InDel)多態(tài)性位點(diǎn)。通過與NR、NT、SwissProt、GO、KOG

4、、PFAM、KO等多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組中包含大量響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏、溫度脅迫、光脅迫等逆境脅迫以及抗氧化系統(tǒng)等相關(guān)功能基因，也發(fā)現(xiàn)許多發(fā)育過程相關(guān)功能基因。通過KEGG代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)了瑪氏骨條藻中包含225條代謝途徑，其中包括與細(xì)胞生長(zhǎng)和衰亡相關(guān)的細(xì)胞周期途徑、細(xì)胞凋亡途徑，參與運(yùn)輸和分解代謝的內(nèi)吞作用途徑，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路、鈣離子信使通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與蛋白質(zhì)折疊、分選和降解的泛素

5、介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解通路，以及糖酵解/糖異生代謝通路、丙酮酸鹽代謝通路、脂肪酸生物合成與代謝通路、不飽和脂肪酸生物合成通路等。
　　(2)為了研究不同生長(zhǎng)期的表達(dá)譜特征，將瑪氏骨條藻指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的9個(gè)樣品分別建庫(kù)和Illumina測(cè)序（每個(gè)處理組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)），每個(gè)處理組樣品獲得7.74M-12.86M干凈的短讀長(zhǎng)序列，且與瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組可比對(duì)(map)上的短讀長(zhǎng)序列數(shù)占短讀長(zhǎng)序列總數(shù)的
　　92.

6、16％-94.55％。三個(gè)時(shí)期基因差異表達(dá)分析表明，1544個(gè)基因在瑪氏骨條藻生長(zhǎng)穩(wěn)定期與指數(shù)期細(xì)胞中存在顯著差異表達(dá)，衰亡期和指數(shù)期之間差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)為2706個(gè)，而穩(wěn)定期與衰亡期差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)僅有95個(gè)，表明兩個(gè)生長(zhǎng)期之間基因表達(dá)模式比較相似。通過GO富集和KEGG富集分析，這些差異表達(dá)的基因涉及到多個(gè)生物學(xué)功能的調(diào)控，例如能量代謝、脂肪酸合成與代謝、細(xì)胞骨架與微管運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等。研究還發(fā)現(xiàn)，瑪氏骨條藻微管與細(xì)胞骨架

7、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活力從指數(shù)期到衰亡期持續(xù)下調(diào)。
　　(3)為了研究瑪氏骨條藻響應(yīng)溫度脅迫環(huán)境的表達(dá)譜特征，將瑪氏骨條藻在低溫脅迫、高溫脅迫、常溫培養(yǎng)的樣品分別建庫(kù)和Illumina測(cè)序，每個(gè)處理組樣品獲得10.60M-14.46M干凈的短讀長(zhǎng)序列，且與瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組可比對(duì)(map)上的短讀長(zhǎng)序列數(shù)占短讀長(zhǎng)序列總數(shù)的92.16％-93.84％。對(duì)瑪氏骨條藻低溫脅迫和常溫對(duì)照兩個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)表達(dá)差異的unigen

8、e共有1178條，其中有659條基因在低溫脅迫下表達(dá)豐度上調(diào)，519條基因在低溫脅迫下表達(dá)豐度下調(diào)。在高溫脅迫處理的樣品中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的基因共有247條，其中上調(diào)表達(dá)的基因128個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因119個(gè)。低溫脅迫處理樣品中，GO功能顯著富集的基因主要涉及核糖體結(jié)構(gòu)組分、大分子生物合成、結(jié)構(gòu)分子活性、細(xì)胞組分生物合成、光合作用、碳利用等，KEGG代謝通路顯著富集的基因主要涉及卟啉和葉綠素代謝、脂肪酸合成與代謝、生物素代謝、氨基糖和核苷

9、酸糖代謝。高溫脅迫處理樣品中，GO功能顯著富集的基因主要涉及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分、未折疊蛋白結(jié)合、植物細(xì)胞壁生物合成，KEGG代謝通路顯著富集的基因主要涉及細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、MAPK信號(hào)通路、氨基酰tRNA生物合成等代謝通路。
　　(4)為了研究瑪氏骨條藻響應(yīng)低硅脅迫環(huán)境的表達(dá)譜特征，將瑪氏骨條藻在低硅脅迫、對(duì)照組培養(yǎng)的樣品分別建庫(kù)和Illumina測(cè)序，每個(gè)處理組樣品獲得9.60M-12.14M干凈的短讀長(zhǎng)序列，且與瑪氏骨條