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簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多國(guó)家自然科學(xué)基金經(jīng)費(fèi)預(yù)算調(diào)整申請(qǐng)表精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：如何成功申請(qǐng)國(guó)家自然科學(xué)基金第一部分基金委面上項(xiàng)目評(píng)審基本程序及重要環(huán)節(jié)初審由各學(xué)科處組織實(shí)施。①申請(qǐng)者不具備申請(qǐng)資格或違反有關(guān)規(guī)定；②手續(xù)不完備或申請(qǐng)書(shū)不符合要求③內(nèi)容不符合資助范圍或超出資助能力④申請(qǐng)者以往資助項(xiàng)目執(zhí)行不利。查重由基金委信息中心組織實(shí)施。①高職申請(qǐng)與承擔(dān)（含參加）面上、重點(diǎn)、重大累計(jì)不超過(guò)3項(xiàng)；②在職研究生不作為限項(xiàng)申請(qǐng)的條件但只可申請(qǐng)面上項(xiàng)目；③申請(qǐng)者同期只能申請(qǐng)一項(xiàng)，每個(gè)項(xiàng)目申請(qǐng)者限為一人④高職申請(qǐng)者當(dāng)年申請(qǐng)及承擔(dān)的在研面上項(xiàng)目累計(jì)不超過(guò)兩項(xiàng)⑤不具有高職的申請(qǐng)者申請(qǐng)及負(fù)責(zé)的在研面上項(xiàng)目不超過(guò)一項(xiàng)⑥青年基金只能獲得一項(xiàng)資助。同行評(píng)議（一審）由基金委各學(xué)科處組織實(shí)施?；境绦蛎糠萆暾?qǐng)書(shū)選擇同行評(píng)議專家（5位）；函請(qǐng)同行評(píng)議對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行定性定量評(píng)價(jià)；收回評(píng)議卡；對(duì)定量部分進(jìn)行計(jì)算機(jī)判讀、打分、排序；據(jù)學(xué)科資助項(xiàng)目數(shù)130％確定第二輪評(píng)審項(xiàng)目。專家評(píng)審組或?qū)I(yè)委員會(huì)評(píng)審（二審）。主要對(duì)一審?fù)扑]項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)議，篩除30％。再次對(duì)二審會(huì)確定資助項(xiàng)目進(jìn)行審查進(jìn)一步查重；以往承擔(dān)項(xiàng)目是否按期完成；是否有違反基金委有關(guān)申請(qǐng)規(guī)定?；鹞瘑T會(huì)委務(wù)會(huì)審議。下發(fā)批準(zhǔn)、未批準(zhǔn)通知。第二部分如何撰寫(xiě)國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書(shū)一、摘要（限400字）包括研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義等如“用方法（手段）進(jìn)行研究，探索證明問(wèn)題，對(duì)闡明機(jī)制／揭示規(guī)律有重要意義，為奠定基礎(chǔ)／提供思路”采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫(kù)并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細(xì)胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。二、立論依據(jù)對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，論述項(xiàng)目科學(xué)意義對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問(wèn)題論述其應(yīng)用前景在研究領(lǐng)域（疾病防治）層面從研究方向展開(kāi)圍繞本項(xiàng)目擬解決的問(wèn)題進(jìn)行歸納分析提出設(shè)想從研究領(lǐng)域（疾病防治）切入研究意義立論依據(jù)1、項(xiàng)目的研究意義存在問(wèn)題對(duì)科學(xué)意義闡述不足或夸大。撰寫(xiě)方法從疾病入手，簡(jiǎn)述其特點(diǎn)、危害，目前主要的治療方法及其存在的問(wèn)題。簡(jiǎn)要分析該病發(fā)病機(jī)理和主要研究熱點(diǎn)，引出目前存在的主要問(wèn)題，也就是本項(xiàng)目要解決的問(wèn)題，以此為切入點(diǎn)提出假設(shè)，闡述如果實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，對(duì)該病甚至相關(guān)疾病的預(yù)防、治療具有的理論意義和臨床價(jià)值。老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類第一位的致盲疾病。迄今為止治療白內(nèi)障唯一有效的方法是通過(guò)手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花費(fèi)的資金已成為世界各國(guó)包括富裕的發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病時(shí)間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會(huì)減少451。所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過(guò)預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑征服白內(nèi)障已成為一項(xiàng)全球性的社會(huì)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題2。但是目前我們對(duì)老年性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)還不十分清楚。多年以來(lái)許多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)晶狀體上皮細(xì)胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對(duì)其中進(jìn)一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點(diǎn)，以晶狀體上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達(dá)的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對(duì)其功能進(jìn)行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。2、國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析（綜述）存在問(wèn)題文獻(xiàn)復(fù)習(xí)不夠，對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解，提出的問(wèn)題別人已解決低水平重復(fù)。對(duì)研究方法不熟悉，簡(jiǎn)單移植或夸大其作用，缺乏實(shí)際應(yīng)用的可行性無(wú)法實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。已有方法與掌握方法的人的結(jié)合；方法理論上可行與現(xiàn)實(shí)可行性的結(jié)合。對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀只是簡(jiǎn)單羅列，缺乏歸納分析，缺乏邏輯性和針對(duì)性總結(jié)與表達(dá)不夠。撰寫(xiě)方法要緊緊圍繞本次申請(qǐng)項(xiàng)目的主題。1、從疾病切入，簡(jiǎn)要論述國(guó)內(nèi)外研究成果，并引出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。2、從研究方向展開(kāi)，較詳細(xì)地分析國(guó)內(nèi)外在本方向的研究進(jìn)展，引出闡明疾病發(fā)病機(jī)理或發(fā)明新的治療方法的關(guān)鍵問(wèn)題所在。3、圍繞關(guān)鍵問(wèn)題，詳細(xì)論述國(guó)內(nèi)外以往的研究結(jié)果、當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢(shì)。綜合分析后提出目前尚未解決的問(wèn)題。4、對(duì)擬采用的技術(shù)方法進(jìn)行介紹和分析。成熟的方法要簡(jiǎn)要介紹，重點(diǎn)闡明可以應(yīng)用于本研究的依據(jù)。新方法要詳細(xì)介紹其原理，并闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。要特別注意的問(wèn)題必須對(duì)項(xiàng)目中所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程及在實(shí)際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題要十分清楚，絕不能是一種簡(jiǎn)單的移植。例如單鏈抗體功能基團(tuán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合，但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化”等問(wèn)題。5、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。防治白內(nèi)障必須針對(duì)其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細(xì)胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。因?yàn)榫铙w上皮細(xì)胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細(xì)胞還是晶狀體中受外來(lái)刺激影響較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異35。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)多種因素H2O2、UVB、晶狀體蛋白的自身抗體誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)68。因此，從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制是問(wèn)題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問(wèn)題。白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性多種基因表達(dá)的改變。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面一是對(duì)體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究。UVB輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其NAKATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有CFOS基因的表達(dá)增加；還有組蛋白H4、H3的低表達(dá)和蛋白酶C、Β肌動(dòng)蛋白、Γ肌動(dòng)蛋白基因的高表達(dá)912。CARPER等13利用RTPCRDDREVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTIONDIFFERENTIALDISPLAY技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細(xì)胞色素B、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少以及細(xì)胞因子的核蛋白、替代拼接因子2（ALTERNATIVESPLICINGFACT）、Β三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達(dá)的增加。二是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。波形纖維蛋白基因（VIMENTIN）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢(shì)。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制1415。GONG等16報(bào)告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白Α3（Α3CONNEXIN）基因敲除小鼠（KNOCKOUTMOUSE）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。三是對(duì)人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。LEE17利用RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、Α平滑肌蛋白、TGFΒ1、TGFΒ2、TGFΒⅡ型受體、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)有差異。KANTOW等18利用RTPCRDD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個(gè)高表達(dá)基因和12個(gè)低表達(dá)的基因。但就DDPCR技術(shù)來(lái)講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽(yáng)性以及克隆全長(zhǎng)CDNA的問(wèn)題。上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。尋找白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（SUBTRACTIVEHYBRIDIZATIONSH），它是，但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。經(jīng)過(guò)改進(jìn)后的抑制性消減雜交（SUPPRESSIONSUBTRACTIVEHYBRIDIZATIONSSH是DIATCHENKO等1996年建立的方法）簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問(wèn)題很多。我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)19，20，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，能夠獲得目的細(xì)胞特異表達(dá)的全長(zhǎng)基因，對(duì)低豐度基因也能有效分離。該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長(zhǎng)CDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效?；蛐酒窃?996年被提出并開(kāi)始研制的，該技術(shù)是將成千上萬(wàn)的DNA探針集中到1厘米見(jiàn)方的基片上，利用堿基互補(bǔ)原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測(cè)定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動(dòng)閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對(duì)檢測(cè)基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。由于目前尚沒(méi)有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立CDNA文庫(kù)，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過(guò)以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們?cè)诰铙w上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。注意事項(xiàng)注意邏輯性和層次感，并隨時(shí)點(diǎn)題。文字表達(dá)要精雕細(xì)琢，避免假大空。參考文獻(xiàn)必須提供作者全名、出處。參考文獻(xiàn)必須引用02年甚至03年的文獻(xiàn)。要注意參考國(guó)內(nèi)相關(guān)專業(yè)知名專家的論著。文獻(xiàn)回顧不能回避國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展。三、研究方案1、研究目標(biāo)存在問(wèn)題目標(biāo)過(guò)大撰寫(xiě)要求有限目標(biāo)，與研究?jī)?nèi)容相呼應(yīng)如探索問(wèn)題，明確關(guān)系，揭示規(guī)律，闡明原理（機(jī)制），建立方法等研究目標(biāo)篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，為防治白內(nèi)障提供線索。2、研究?jī)?nèi)容存在問(wèn)題內(nèi)容過(guò)多，一個(gè)研究周期難以完成；內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)。撰寫(xiě)要求內(nèi)容要適當(dāng)，確保研究周期內(nèi)完成；與目標(biāo)相輔相成，為研究目標(biāo)服務(wù)。篇幅要適度，注意與技術(shù)路線區(qū)別。確定研究目標(biāo)、內(nèi)容的依據(jù)回答一個(gè)科學(xué)問(wèn)題；根據(jù)研究周期、資助強(qiáng)度來(lái)確定。研究?jī)?nèi)容（1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立CDNA文庫(kù)。制備差異表達(dá)基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個(gè)標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)對(duì)白內(nèi)障相關(guān)基因CDNA進(jìn)行特異擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定，測(cè)定基因序列，分析基因的結(jié)構(gòu)，獲得全長(zhǎng)基因。（3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用利用反轉(zhuǎn)錄病毒，對(duì)培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞和在體小鼠晶狀體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，觀察白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)铙w上皮細(xì)胞的影響以及在白內(nèi)障形成中的作用。觀察指標(biāo)如下①存活細(xì)胞數(shù)；②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化；③細(xì)胞凋亡檢測(cè)用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA水平分析細(xì)胞凋亡；④細(xì)胞增殖的檢測(cè)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)核蛋白KI67；⑤細(xì)胞骨架蛋白（VIMENTIN、ACTIN）的檢測(cè)用NTHERN雜交法檢測(cè)VIMENTIN、ACTINMRNA的表達(dá)，用SDSPAGE及WESTERNBLOT方法檢測(cè)波形纖維蛋白、肌動(dòng)蛋白（均為尿素溶性蛋白）；⑥晶狀體蛋白的檢測(cè)用SDSPAGE方法觀察水溶性蛋白Α、Β、Γ晶狀體蛋白的變化。3、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題存在問(wèn)題未能抓住關(guān)鍵問(wèn)題或抓得不準(zhǔn)。撰寫(xiě)要求找出關(guān)鍵問(wèn)題，寫(xiě)出解決辦法。什么是關(guān)鍵問(wèn)題研究過(guò)程中對(duì)達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究?jī)?nèi)容或因素。為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題（1）建立差異表達(dá)的CDNA文庫(kù)建立差異CDNA文庫(kù)是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異CDNA文庫(kù)具有代表性，我們采取以下解決方案①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫(kù)的MRNA的來(lái)源。②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達(dá)的完整CDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。（2）制備基因芯片制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時(shí)做到①嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行；②在標(biāo)本的處理及RNA提取時(shí)避免污染，否則即會(huì)造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行操作就可以避免發(fā)生差錯(cuò)。（3）在體基因轉(zhuǎn)染在體基因轉(zhuǎn)染是進(jìn)行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在體的晶狀體上皮細(xì)胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細(xì)胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過(guò)晶狀體的囊膜，針對(duì)以上問(wèn)題我們擬采取下列方法解決①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（LENTIVIRALVECT），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細(xì)胞的局限性，對(duì)分裂后細(xì)胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對(duì)在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑12ΜM玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細(xì)胞。4、研究方法存在問(wèn)題過(guò)于簡(jiǎn)單在實(shí)驗(yàn)方案中只有方法名稱而無(wú)具體步驟。過(guò)于繁雜大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。撰寫(xiě)要求以研究項(xiàng)目的需求為前提，盡量采用目前最先進(jìn)的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。本課題主要利用改良消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)篩選老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞有差異表達(dá)的基因，分析其結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其功能，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)探討其在晶狀體上皮細(xì)胞變化、白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮細(xì)胞的角度揭示老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。5、技術(shù)路線存在問(wèn)題不清楚，不詳細(xì)。撰寫(xiě)要求清晰、詳細(xì)、注意邏輯性。撰寫(xiě)方法以時(shí)間順序?yàn)橹骶€設(shè)計(jì)技術(shù)路線以研究?jī)?nèi)容為主線設(shè)計(jì)技術(shù)路線分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。詳細(xì)地寫(xiě)清楚每個(gè)具體步驟。（1）人晶狀體上皮細(xì)胞的獲得老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜），直徑約5MM。正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8MM。按文獻(xiàn)提供的方法去除晶狀體纖維細(xì)胞，仔細(xì)清洗以去除血細(xì)胞污染。（2）建立差異CDNA文庫(kù)從50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，利用改良的消減雜交技術(shù)19，20，獲得差異表達(dá)的CDNA，并建立文庫(kù)。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下正常晶狀體上皮細(xì)胞白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞PROMEGAPOLYATTRACTSYSTEM1000MRNA分離MRNA分離OLIGODT18反轉(zhuǎn)錄NTECHCAPFINDER方法反轉(zhuǎn)錄CDNABIOTIN21DUTPPENDINGCDNA隨機(jī)引物PCR雜交SEPHACRYLS400柱除鹽及小片段鏈親和素生物素磁性分離除去雜交體及過(guò)量正常晶狀體上皮細(xì)胞CDNA“長(zhǎng)距離”P(pán)CR目的CDNA的特異擴(kuò)增克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化建立差異基因文庫(kù)（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因①基因芯片的制備②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選取10例正常晶狀體前囊膜上的晶狀體上皮細(xì)胞為對(duì)照組。分次取老年性白內(nèi)障前囊膜200例，分成20組，每組10例，取上皮細(xì)胞。提取上皮細(xì)胞中總RNA，分離純化MRNA。采用RTPCR技術(shù)將其反轉(zhuǎn)錄為CDNA并用熒光標(biāo)記，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法（SCHENAMETALSCIENCE1995170467）進(jìn)行雜交。雜交后用氬離子束激發(fā)熒光標(biāo)志，經(jīng)閱讀器識(shí)別、計(jì)算機(jī)分析，獲得雜交的定量結(jié)果。統(tǒng)計(jì)20次每個(gè)CDNA片段的雜交陽(yáng)性率和強(qiáng)度，確定篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出可能與白內(nèi)障關(guān)系密切的基因片段。4白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析①序列測(cè)定②序列的計(jì)算機(jī)分析A基因片段的同源性分析B氨基酸序列的同源性分析C基因序列的編碼區(qū)分析D局部組成復(fù)雜性分析E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析③獲得全長(zhǎng)基因5基因轉(zhuǎn)染A、培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染①存活細(xì)胞數(shù)②細(xì)胞凋亡的檢測(cè)③細(xì)胞增殖的檢測(cè)④細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè)⑤晶狀體蛋白的檢測(cè)B、在體晶狀體的轉(zhuǎn)染①形態(tài)學(xué)觀察②取晶體前囊膜，分離其下晶狀體纖維，作A中③④項(xiàng)檢測(cè)。通過(guò)以上研究，分析白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)w上皮細(xì)胞的作用及與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系。6、可行性分析理論分析研究手段、方法分析預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析所用特殊實(shí)驗(yàn)材料（試劑）的分析對(duì)所具備的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析對(duì)項(xiàng)目組成員搭配及其運(yùn)用技術(shù)方法的能力分析1關(guān)于建立差異CDNA文庫(kù)老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞是處在不同狀態(tài)下的細(xì)胞，細(xì)胞基因表達(dá)的改變是細(xì)胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基因是探索細(xì)胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的消減雜交技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。改良的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因，這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了該方法的可操作性，而且我們?cè)谶\(yùn)用此方法過(guò)程中也積累了較豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，本研究利用這一方法從兩種狀態(tài)的晶狀體上皮細(xì)胞中篩選差異表達(dá)的基因并建立CDNA文庫(kù)是可行的。2關(guān)于制備基因芯片和篩選白內(nèi)障相關(guān)基因3關(guān)于白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析4關(guān)于在體基因轉(zhuǎn)染的可行性分析綜上所述，我們的研究方案從理論到實(shí)踐都是可行的，實(shí)驗(yàn)中所涉及到的材料和試劑均為商品，本校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室為全軍開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室、基因研究所、中心實(shí)驗(yàn)室及本實(shí)驗(yàn)室具備完成該項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)條件，預(yù)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目的預(yù)期目標(biāo)。7、創(chuàng)新性對(duì)創(chuàng)新的理解創(chuàng)新性與先進(jìn)性是有根本區(qū)別的。原始創(chuàng)新填補(bǔ)空白或修改傳統(tǒng)的理論；新技術(shù)、新方法的發(fā)明創(chuàng)造。跟蹤創(chuàng)新在前人工作基礎(chǔ)上補(bǔ)充、完善現(xiàn)有理論；對(duì)原有技術(shù)、方法進(jìn)行修改后產(chǎn)生1＋1＞2的效果。（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫(kù)，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。這使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得白內(nèi)障相關(guān)基因。通過(guò)分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。（2）基因功能研究上的創(chuàng)新8、年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果年度研究計(jì)劃按年度列出研究?jī)?nèi)容及其階段目標(biāo)；擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、國(guó)際合作與交流計(jì)劃等。預(yù)期研究結(jié)果理論成果建立豐富補(bǔ)充填補(bǔ)技術(shù)方法建立完善專利可望獲得論文國(guó)際、國(guó)內(nèi)人才培養(yǎng)青年科技骨干、博碩研究生研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展200101200112（1）采用改良的消減雜交技術(shù)篩選白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因，建立CDNA文庫(kù)。（2）制備白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因芯片。200201200212200301200312預(yù)期的研究成果通過(guò)本項(xiàng)目的系統(tǒng)研究，有望闡明老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，從晶狀體上皮細(xì)胞的角度揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理，為白內(nèi)障防治提供理論依據(jù)。研究成果以論文和科技進(jìn)步獎(jiǎng)提供。預(yù)計(jì)在國(guó)際、國(guó)內(nèi)期刊上發(fā)表論文810篇。四、研究基礎(chǔ)1、工作基礎(chǔ)存在問(wèn)題內(nèi)容過(guò)簡(jiǎn)；與申請(qǐng)項(xiàng)目無(wú)關(guān)。撰寫(xiě)要求要介紹與申請(qǐng)項(xiàng)目直接相關(guān)的研究結(jié)果；提供有關(guān)的研究論文、成果及專利等材料；以往應(yīng)用與申請(qǐng)項(xiàng)目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷。工作積累也要包括項(xiàng)目組成員的所有信息。（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ)本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有（2）有關(guān)基因轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)（3）有關(guān)老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)2、工作條件包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑，包括利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況。3、申請(qǐng)者及項(xiàng)目組成員簡(jiǎn)歷所有項(xiàng)目組成員的工作簡(jiǎn)歷及發(fā)表相關(guān)論著均應(yīng)介紹，尤其是要針對(duì)項(xiàng)目組成員的分工介紹研究工作經(jīng)歷。第三部分科研選題一、科研選題的意義愛(ài)因斯坦指出“提出一個(gè)問(wèn)題往往比解決一個(gè)問(wèn)題更重要，因?yàn)榻鉀Q一個(gè)問(wèn)題也許僅僅是一個(gè)數(shù)學(xué)上或?qū)嶒?yàn)上的技能而已。而提出新的問(wèn)題，新的可能性，以新的角度去看舊的問(wèn)題，卻需要?jiǎng)?chuàng)造性的想象力，而且標(biāo)志著科學(xué)的真正進(jìn)步。”選擇課題、確定主攻方向是科學(xué)研究中具有戰(zhàn)略意義的首要問(wèn)題。二科研選題的原則1、需要性原則選擇有重大意義或急需解決的問(wèn)題。2、目的性原則目標(biāo)集中，不含糊，不籠統(tǒng)。3、創(chuàng)新性原則針對(duì)科學(xué)而言，沒(méi)有地域性。4、先進(jìn)性原則針對(duì)技術(shù)而言，有地域性。5、科學(xué)性原則有依據(jù)；符合客觀規(guī)律；設(shè)計(jì)科學(xué)。6、可行性原則主要技術(shù)指標(biāo)實(shí)現(xiàn)的可能性。7、效能性原則社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益、應(yīng)用價(jià)值等。三、科技人員如何選題1、課題的概念為探索醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的某個(gè)具體的理論、方法或技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)假說(shuō)機(jī)時(shí)設(shè)計(jì)的旨在說(shuō)明三要素（受試對(duì)象、施加因素、效應(yīng)結(jié)果）及其相互關(guān)系并在一定時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)的最基本的單元。課題最基本的特征是的探索，其指向是具體的理論、方法或技術(shù)問(wèn)題；課題要根據(jù)假說(shuō)、經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)；課題的核心是要說(shuō)明三要素及其相互關(guān)系；課題是有時(shí)空觀念的，即有邊界、有期限的。2、選題的基本程序（1）提出問(wèn)題A、問(wèn)題通常產(chǎn)生于觀察與理論之間的矛盾；B、問(wèn)題產(chǎn)生于懷疑精神與科學(xué)的創(chuàng)造性思維的結(jié)論；C、根據(jù)生產(chǎn)和實(shí)際需要提出問(wèn)題。醫(yī)學(xué)課題屬此類。（2）查閱文獻(xiàn)，提出假說(shuō)建立假說(shuō)是科研工作的前提和靈魂；假說(shuō)要以科學(xué)的實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，在此基礎(chǔ)上要敢于大膽設(shè)想。（3）確定題目體現(xiàn)三要素；體現(xiàn)假說(shuō)內(nèi)容；留有余地；言簡(jiǎn)意賅，用詞具體；25個(gè)漢字，不用縮寫(xiě)。（4）提出科研設(shè)計(jì)專業(yè)設(shè)計(jì)；統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)。3、選題的基本方法A、同步選擇法與科技發(fā)展前沿、主流同步；B、階段分析選擇法根據(jù)學(xué)科發(fā)展不同階段；C、交叉點(diǎn)選擇法不同學(xué)科的交叉點(diǎn)；D、移植選擇法將某學(xué)科方法移植到另一學(xué)科；E、機(jī)遇線索捕捉法偶然發(fā)現(xiàn)、思想火花等；F、經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)移選擇法用解決某問(wèn)題的經(jīng)驗(yàn)去解決

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