抗卵泡刺激素受體(FSHR)納米抗體對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥作用效果的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松（Osteoporosis）是指在骨形成過(guò)程中，破骨細(xì)胞增長(zhǎng)速率大于成骨細(xì)胞的增長(zhǎng)。卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是垂體前葉嗜堿粒細(xì)胞分泌的一種激素，主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性骨代謝調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，F(xiàn)SH水平增高與性機(jī)能減退引起的骨質(zhì)疏松有密切關(guān)系，并且FSH對(duì)骨質(zhì)的作用不依賴于雌激素水平的變化，阻斷FSH的作用不僅能通過(guò)抑制骨的再吸收而顯著減少

2、骨的流失，而且還能促進(jìn)骨的重建。
　　在成年人和動(dòng)物中，F(xiàn)SHR主要表達(dá)在睪丸支持細(xì)胞和卵巢粒層細(xì)胞表面， FSHR也在成熟的人破骨細(xì)胞(OC)及破骨細(xì)胞前體即單核細(xì)胞表面表達(dá)，成為阻斷FSH作用的潛在靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)SH與骨質(zhì)疏松（OP）具有密切聯(lián)系，在一定范圍內(nèi)阻斷FSH水平的升高在骨質(zhì)疏松癥的治療方面已經(jīng)取得了一定效果。納米抗體作為一種新型的單域抗體具有分子量小、穩(wěn)定性好、可溶性高，易與受體結(jié)合等優(yōu)勢(shì)從而發(fā)揮一定的生理功能。

3、本研究的主要目的在于制備抗FSHR納米抗體，探討FSHR抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果，主要包括以下幾部分內(nèi)容：
　　1、噬菌體展示技術(shù)從駱駝免疫抗體文庫(kù)中篩選抗FSHR納米抗體
　　對(duì)FSHR免疫的駱駝VHH噬菌體展示文庫(kù)經(jīng)過(guò)3輪淘洗篩選，獲得了63個(gè)陽(yáng)性克隆，其中選擇豐度最高的2個(gè)克隆VHH-3F9與VHH-3F19，豐度較低的一個(gè)序列VHH-3F20以及單獨(dú)序列中隨機(jī)的2個(gè)VHH-3F8與VHH-3F10等5個(gè)VH

4、H基因序列，將其構(gòu)建至pET22b載體，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，Ni-離子親和色譜純化抗體蛋白，獲得了以上5個(gè)抗FSHR納米抗體。經(jīng)ELISA驗(yàn)證只有VHH-3F9與VHH-3F19能與FSHR結(jié)合，且VHH-3F9結(jié)合能力較高，另外4個(gè)納米抗體不結(jié)合。從而獲得了可以在上清和胞間質(zhì)均表達(dá)的抗FSHR納米抗體VHH-3F9，且濃度及純度較高。ELISA及Western Blot檢測(cè)該抗體能與FSHR特異性結(jié)合，且VHH-3F9納米抗體具有部

5、分體外阻斷能力，測(cè)定其溫度穩(wěn)定性得知在37℃處理12 h仍保留70％的活性。
　　2、制備抗FSHR駱駝多克隆抗體
　　以原核表達(dá)純化的FSHR234蛋白為抗原，對(duì)新疆雙峰駝進(jìn)行免疫，每隔兩周加強(qiáng)免疫，共免疫七次。在第七次加強(qiáng)免疫兩周后，對(duì)駱駝進(jìn)行免疫后采血，間接ELISA法測(cè)定抗FSHR多克隆抗體的血清效價(jià)達(dá)到128000大量收集駱駝免疫后血清，采用Protein A柱子親和純化駱駝未免疫血清與免疫后血清，獲得抗FSHR駱

6、駝多克隆抗體總IgG。ELISA測(cè)得駱駝抗FSHR多克隆抗體IgG的最低反應(yīng)濃度為0.0625μg/ml。體外檢測(cè)抗FSHR抗體與caov-3細(xì)胞表面FSHR的結(jié)合，細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VHH-3F9納米抗體和抗FSHR駱駝多克隆抗體IgG與caov-3細(xì)胞表面的FSHR均有結(jié)合，且多抗IgG結(jié)合能力較高，VHH-3F9有部分結(jié)合能力。
　　3、利用雙側(cè)卵巢切除建立SD大鼠骨質(zhì)疏松癥模型
　　本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠隨機(jī)

7、分為兩組，分別是去勢(shì)OVX組和對(duì)照SHAM組。去勢(shì)后檢測(cè)雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）等雌激素水平以及骨密度（BMD）以評(píng)價(jià)建立的骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)10周齡大鼠去勢(shì)2周后，與SHAM組相比，OVX組E2水平顯著下降（P<0.01），且在2到5周內(nèi)保持平穩(wěn)狀態(tài)。FSH及LH水平均顯著增加（P<0.05），且在2到5周內(nèi)增加趨勢(shì)緩慢，達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定水平。繼續(xù)飼養(yǎng)3周，即去勢(shì)8周后測(cè)定SD大鼠骨密度（BM

8、D）水平，結(jié)果表明OVX組骨密度顯著低于SHAM組（P<0.05），從而驗(yàn)證骨質(zhì)疏松癥模型成立。
　　4、抗FSHR抗體對(duì)SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療
　　采用尾靜脈注射治療骨質(zhì)疏松癥SD大鼠，納米抗體VHH-3F9以及駱駝抗FSHR多克隆抗體IgG，按相同劑量即2 mg／kg，亮丙瑞林（LE）按1.6 mg／kg，對(duì)照組注射200μl的PBS。各組每周均治療2次，共治療6周。采血進(jìn)行血清各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，觀察每組對(duì)SD大鼠骨質(zhì)疏松

9、癥的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照SHAM組相比，實(shí)驗(yàn)組E2水平均顯著降低（p<0.05），而各組之間并無(wú)差異。隨著去勢(shì)后OVX組FSH水平的逐漸增加，VHH-3F9、IgG注射骨質(zhì)疏松癥SD大鼠明顯抑制了FSH的增加，且IgG效果強(qiáng)于VHH-3F9，但是差異并不顯著。OVX+LE組，隨著注射LE時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)SH水平顯著降低，發(fā)現(xiàn)LE的施加顯著抑制FSH（P<0.05）。LH的變化與FSH趨勢(shì)一致，但OVX+VHH-3F9組LH水平高于O

10、VX+IgG組。從而通過(guò)抑制FSH而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。
　　綜上所述，本研究在建立SD大鼠骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)從噬菌體免疫文庫(kù)中篩選得到親和力較高的抗FSHR納米抗體，免疫駱駝得到效價(jià)較高的抗FSHR多克隆抗體IgG，并用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療，以亮丙瑞林作為抑制FSH激素水平的對(duì)照，以確定抗FSHR抗體對(duì)于大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果。為將來(lái)進(jìn)一步預(yù)防骨質(zhì)疏松篩選有效藥物做一基礎(chǔ)研究，以便用于臨床診斷