外源NO對兩種園林草本植物重金屬脅迫的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其機制.pdf

1、近年來，土壤重金屬污染已直接危害到生態(tài)環(huán)境和人體健康，因而對其修復(fù)治理已成為全球范圍亟待解決的問題。植物修復(fù)技術(shù)以其安全、廉價特點正成為全世界研究和開發(fā)熱點。目前，大部分超富集植物生長緩慢、重金屬遷移量較小、景觀價值不高，或其生長地域性較強，僅適合作重金屬抗性機理的理論研究，不適宜城市（或城郊）大面積污染土壤修復(fù)。然而，園林植物特別是草本植物具有相對生物量大、種類多、生長快等特點，且生長一段時間后會被整株移出，不會造成土壤二次污染，而且

2、可以獲得良好的景觀效果、生態(tài)效應(yīng)以及經(jīng)濟(jì)價值。若能從繁多的園林植物資源中篩選出修復(fù)重金屬污染土壤具重要作用的植物，也將為土壤重金屬污染的植物修復(fù)開辟新途徑。本研究以兩種重要的耐重金屬脅迫園林草本植物[白車軸草(Trifolium repens)和長春花(Catharanthus roseus)]為試驗材料，利用代謝組學(xué)、蛋白免疫印跡技術(shù)、熒光顯微技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)等方法，研究了土壤重金屬(Cd/Cu)脅迫處理不同時間(45

3、d、60 d和80 d)對兩種草本植物在代謝、蛋白及轉(zhuǎn)錄層面的影響，同時也探討了外源NO施加（或噴施）對其重金屬脅迫的調(diào)節(jié)機理。本研究中，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.高濃度土壤Cd處理(＞50.00mg·kg-1)45 d顯著抑制白車軸草幼苗生長、生物量及碳(C)、氮(N)、磷(P)和鉀(K)的累積，明顯改變生物量與養(yǎng)分積累與分配;而較低Cd處理(≤25.00 mg·kg-1)則對其無明顯影響。通過蛋白免疫印跡法(WB）及酶

4、活性測定表明，50.00 mg·kg-1土壤Cd處理顯著提升葉片單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性和蛋白量以及總硫醇(TT)含量，降低超氧化物歧化酶(SOD)同工酶(CuZn/Mn-SOD)、CAT活性（蛋白量）及抗壞血酸(ASC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、二十二碳六烯酸(DHA)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和非蛋白性硫醇(NPT)含量。對根而言，Cd脅迫增加SOD活性（蛋白量）及TT、ASC含量，顯著降低谷胱甘肽還原酶(GR)、

5、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)活性及DHA、GSSG含量。同時，通過Native-PAGE試驗分析表明，Cd處理顯著降低根CuZn-SOD蛋白活性，增強Mn-SOD蛋白活性;且通過半定量RT-PCR驗證表明Cd處理下調(diào)CAT和CuZn-SOD表達(dá)量，而上調(diào)APX、Fe-SOD、Mn-SOD和GR蛋白在根中表達(dá)量。同時，50.00 mg·kg-1 Cd脅迫顯著提升植株葉片與根ROS[H2O2(DCF-DA)和O2·-(DHE)]與MDA含量

6、，而顯著降低主根與側(cè)根中NO產(chǎn)生量及熒光密度值(DAF-2DA;＞50％)，卻顯著升高葉片中NO產(chǎn)生量(DCF-DA;35％)。盆栽試驗下，白車軸草幼苗均未出現(xiàn)枯萎、死亡等現(xiàn)象，且部分處理下植株組織中Cd2+累積量已超過100.00 mg·kg-1，表明白車軸草對Cd污染具有較強耐性，這為城市園林綠化及Cd污染土壤修復(fù)提供潛力。
　　2.與50 mg·kg-1土壤Cd處理白車軸草45 d相比，施加不同濃度外源SNP（即0、50、1

7、00、200和400μmol·L-1）能有效緩解Cd對幼苗的脅迫效應(yīng)，特別在較低SNP濃度(50μmol· L-1)時效果最為顯著。進(jìn)一步研究表明，與50 mg·kg-1 Cd處理80 d相比，施加50μmol·L-1 SNP顯著提升植物干重及葉綠素含量，上調(diào)植株葉片和根中NO產(chǎn)生量(及熒光密度值;DAF-2DA)，改善植株組織中礦質(zhì)元素[即鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)和銅(Cu)]平衡，增強ROS清除系統(tǒng)代謝，降低組織

8、對Cd2+的吸收從而抵消因Cd誘導(dǎo)的毒害。即便如此，NO清除劑(cPTIO)與NO合成抑制劑(L-NAME)卻淬滅了SNP對植物毒害的緩解作用，降低茉莉酸(JA)和脯氨酸(PRO)累積量;而SNP類似物(SN和SF)對其均無明顯影響。同時，本研究首次證實NO能調(diào)節(jié)質(zhì)子泵ATP酶(PM-H+-ATPase和TV-H+-ATPase)與AMP酶(PM-5'-AMPase)活性，提升根與葉片中JA和PRO含量。綜上所述，外源施加適宜濃度NO(

9、SNP)能通過降低氧化損傷，調(diào)節(jié)礦質(zhì)營養(yǎng)吸收與分配，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)NO合成，重新確立ATP酶活性水平，及平衡體內(nèi)脅迫相關(guān)激素含量，從而有效地緩解重金屬脅迫對白車軸草毒害。
　　3.研究表明，30 mg·kg-1土壤Cu處理60 d顯著升高長春花地上部與根Cu2+累積，降低葉片與根中NO產(chǎn)生量(及熒光密度值;DAF-FM DA)，擾亂礦質(zhì)營養(yǎng)代謝及質(zhì)子泵(H+-ATPase)平衡，從而誘導(dǎo)ROS爆發(fā)。然而，葉片噴施50μmol· L-1

10、 SNP卻顯著緩解Cu脅迫對長春花生長抑制作用。同時，內(nèi)源NO產(chǎn)生量與ROS累積量間互為倒數(shù)關(guān)系。特別地，除絲氨酸(SER)和蛋氨酸(MET)外，SNP處理提升根中其他15種游離氨基酸含量，[Cu+SNP]卻顯著降低其水平，其中僅精氨酸(AGR)、天冬氨酸(ASP)、MET和SER在該處理下與[SNP]處理差異不顯著;而Cu處理對地上部17種游離氨基酸影響較小。與Cu處理相比，[SNP]或[Cu+SNP]處理顯著提升植株地上部水楊酸(S

11、alicylic acid)、丁香酸(Syringic acid)和香草酸(Vanillic acid)含量，以及根中水楊酸、香蘭素(Vanillin)、對羥基苯甲酸(p-OH-benzoic aldehyde)和兒茶酸(Protocatechuic acid)含量;地上部總酚含量與Cu處理間無明顯差異，卻提升根中總酚含量。另一方面，長春花葉片中重要的抗癌生物堿長春新堿(Vincristine)和長春堿(Vinblastine)在Cu脅

12、迫處理下降低，[SNP]處理卻極大提升其含量（+38％和+49％較對照）。噴施SNP也顯著提升葉片與根總生物堿含量，而不同處理對根中重要地抗腫瘤生物堿阿瑪堿(Ajmalicine)卻無明顯影響。因此，該研究首次證實葉片噴施外源SNP能夠參與Cu激活長春花組織中氨基酸、酚醛類化合物以及吲哚生物堿合成與代謝，同時調(diào)節(jié)質(zhì)子泵及礦質(zhì)元素平衡，從而降低土壤Cu毒害。
　　4.利用最新iTRAQ技術(shù)，研究了30 mg·kg-1土壤Cu脅迫60

13、 d時外源NO對長春花葉片蛋白質(zhì)組學(xué)影響。研究顯示，10％置信度水平上總共鑒定到除去冗余蛋白總數(shù)為2560個，Unique肽段數(shù)目19537條;譜圖數(shù)目為114558個，譜圖利用率為32.2％。同時，根據(jù)4標(biāo)記兩次重復(fù)iTRAQ蛋白定量選擇特異肽段數(shù)據(jù)，最后在全比對組(B-A、C-A、C-B、D-A、D-B和D-C組)中鑒定出Global FDR from Fit小于1％可信蛋白數(shù)目為1370個。根據(jù)差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)，在Dynamics

14、中獲得差異表達(dá)蛋白數(shù)目181個。其中，Cu處理(B)與對照組(A)比對獲得差異表達(dá)蛋白144個(55個上調(diào)，88個下調(diào));SNP處理(C)與A比對獲得差異蛋白57個(24個上調(diào)，32個下調(diào));[Cu+SNP]處理(D)與A比對獲得76個(27個上調(diào)，48個下調(diào));C與B比對獲得92個(60個上調(diào)，31個下調(diào));D與B比對獲得97個(55個上調(diào)，41個下調(diào));D與C比對獲得31個(12個上調(diào)，18個下調(diào))。同時，運用GO(Gene Ont

15、ology)[生物過程(BP）、細(xì)胞定位(CC)、分子功能(MF)]、KEGG通路(Kyoto encyclopedia of Genesand Genomes)與PPI交互(Protein-Protein Interaction)作用分析重點分析了B-A、C-B及D-B比對組蛋白變化情況。研究顯示，①[B-A]比對組中參與BP過程的蛋白總數(shù)為1158條，富集到顯著(P＜0.05）功能的蛋白587條;而參與CC的蛋白總數(shù)156條，富集到

16、顯著功能蛋白85條;參與MF的蛋白數(shù)為324條，富集到顯著功能蛋白數(shù)為175條。同時，71條蛋白參與KEGG通路過程，具有顯著功能特性蛋白數(shù)為15條。②[D-B]比對組中參與BP蛋白總數(shù)1065條，富集到顯著功能蛋白數(shù)量530條;參與CC蛋白總數(shù)158條，富集到顯著功能蛋白數(shù)85條;參與MF蛋白數(shù)270條，富集到顯著功能蛋白數(shù)129條。同時，共55條蛋白參與KEGG通路，具有顯著功能特性蛋白數(shù)12條。③[D-B]比對組中參與BP蛋白總數(shù)

17、905條，富集到顯著功能蛋白數(shù)量491條;參與CC蛋白數(shù)133條，富集到顯著功能蛋白數(shù)76條;參與MF蛋白數(shù)為258條，富集到顯著功能蛋白數(shù)為117條。同時，共54條蛋白參與KEGG通路，具有顯著功能特性蛋白數(shù)為14條?？傮w而言，葉片噴施NO能夠調(diào)節(jié)光合作用、二羧酸代謝、核糖體代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、谷胱甘肽代謝以及蛋白轉(zhuǎn)運等過程，表明NO能加速重金屬Cu脅迫下長春花體內(nèi)新陳代謝，增加代謝活動能量供給，增強ROS清除能力，進(jìn)而維持細(xì)胞完