黃芪多糖對內(nèi)毒素誘導的U937細胞分泌炎癥因子的影響及其機制的研究.pdf

1、黃芪多糖(Astragalus Polydsaccharide,APS)是黃芪中最有效,含量最高的成分之一,具有增強免疫器官功能,促進抗體的產(chǎn)生,提高巨噬細胞活性,加強T、B淋巴細胞和NK細胞等免疫細胞的功能等作用。
　　 內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細菌外膜的一種大分子結(jié)構成分,可通過誘導體內(nèi)單核巨噬細胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì),如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)

2、-1β及一氧化氮(NO)等,而導致許多病理生理反應。抑制巨噬細胞所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)已經(jīng)成為抗炎藥物研究和治療的靶點。用LPS誘導單核巨噬細胞U937細胞(經(jīng)PMA誘導分化成熟),建立內(nèi)毒素誘導的細胞模型,研究黃芪多糖對該細胞模型分泌的炎癥因子的影響及相關機制,為黃芪多糖對內(nèi)毒素引起的炎癥反應的治療提供進一步的實驗依據(jù)。主要工作如下:
　　 1.培養(yǎng)人單核巨噬細胞系U937細胞,體外PMA誘導其成熟。通過細胞毒實驗篩選黃芪多糖用藥濃

3、度。結(jié)果顯示,37.5～150μg/ml濃度范圍內(nèi)的黃芪多糖對經(jīng)PMA誘導的U937細胞存活率無明顯影響。
　　 2.LPS誘導U937巨噬細胞,建立炎癥模型,加入不同濃度的黃芪多糖作用48h,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定LPS誘導的U937細胞各組細胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量;采用Griess試劑檢測組細胞上清液中NO的含量;采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測各組細胞TNF-α、IL-1β及i

4、NOS mRNA的表達。結(jié)果顯示,LPS作用于PMA誘導的U937細胞后,細胞上清液中TNF-α、IL-1β及NO的含量明顯增加(P＜0.01)。37.5～150μg/ml的黃芪多糖干預后,含量明顯下降,與LPS組比較有顯著性差異(P＜0.05)。LPS刺激后,TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達顯著升高(P＜0.01)。37.5～150μg/ml的黃芪多糖干預后,TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達與LPS組相

5、比顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(western blot)檢測各組細胞細胞核內(nèi)NF-κB的含量。結(jié)果顯示,U937細胞經(jīng)LPS作用后,細胞內(nèi)NF-κBP65表達水平增高。黃芪多糖作用后,NF-κB P65表達水平與LPS組相比顯著降低。
　　 除了巨噬細胞外,淋巴細胞及樹突狀細胞也是機體重要的免疫細胞。淋巴細胞產(chǎn)生于機體的中樞淋巴器官和周圍淋巴器官,分布于外周血、脾臟

6、、全身各處淋巴結(jié)及PP結(jié)等處,在全身免疫系統(tǒng)及黏膜免疫系統(tǒng)內(nèi)免疫誘導部位及免疫效應部位之間不斷的遷移,同時伴隨著淋巴細胞本身的分化成熟,參與機體的免疫應答。樹突狀細胞(DCs)作為機體功能最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APCs),它能快速有效地攝取、加工處理和遞呈抗原,處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。黃芪多糖對免疫細胞活力及表型的影響可間接反映其免疫調(diào)節(jié)作用。本論文基于此進行以下實驗:<

7、br>　　 1.取小鼠原代外周血單個核細胞、腋下淋巴結(jié)細胞、脾臟淋巴細胞及PP結(jié)淋巴細胞,采用MTT法檢測不同濃度的黃芪多糖對ConA誘導的細胞活力的影響。結(jié)果顯示,37.5～300μg/ml濃度范圍內(nèi)的黃芪多糖能夠促進ConA誘導的外周血單個核細胞、腋下淋巴結(jié)細胞、脾臟淋巴細胞及PP結(jié)淋巴細胞增殖(P＜0.05)。
　　 2.取小鼠原代骨髓來源單個核細胞,體外rmGM-CSF和IL-4誘導6天后,加入濃度為150μg/ml的