糖肽結(jié)構(gòu)解析與定量研究的組學(xué)技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)糖基化是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣的修飾類型，糖基化修飾對蛋白質(zhì)的功能有重要影響，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，位點(diǎn)特異性的糖鏈結(jié)構(gòu)解析對揭示糖蛋白的生物學(xué)功能有重要意義。常規(guī)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，常利用內(nèi)切糖苷酶PNGase F切除糖鏈后，再鑒定糖修飾肽段及修飾位點(diǎn)。但糖鏈的切除，導(dǎo)致了糖型不均一性結(jié)構(gòu)的缺失，同時(shí)，自發(fā)脫氨基現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致糖修飾位點(diǎn)鑒定的假陽性結(jié)果。因此，發(fā)展能在完整糖肽水平上實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、高準(zhǔn)確性的糖肽結(jié)構(gòu)解

2、析技術(shù)，是糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究需重點(diǎn)解決的技術(shù)難題，也是本研究所關(guān)注的核心內(nèi)容。
　　本論文主要內(nèi)容分為三個(gè)章節(jié)。
　　第一章，首先介紹了糖基化修飾對蛋白質(zhì)功能的影響和糖基化修飾的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其次介紹了常用的糖肽分離富集策略和生物質(zhì)譜檢測方法，同時(shí)還介紹了蛋白質(zhì)核心巖藻糖修飾在臨床研究與蛋白質(zhì)功能調(diào)控中的意義。
　　第二章，建立了序列式內(nèi)切酶輔助的糖鏈結(jié)構(gòu)解析策略。在這項(xiàng)工作中，我們建立了一種位點(diǎn)特異性的糖鏈結(jié)構(gòu)解析策略，可

3、用于實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品中完整N-糖肽的高可靠性鑒定。該策略首先是使用ZIC-HILIC富集蛋白酶解物中的完整糖肽。其次，將糖肽的一部分使用內(nèi)切糖苷酶H（Endo H）處理以去除高甘露糖型（Man）和雜合型N-連接的糖鏈。接著再將一部分Endo H處理后的糖肽進(jìn)一步在18O水中進(jìn)行PNGase F處理以除去剩余的復(fù)合型糖鏈。通過RPLC-MS/MS分析三步處理所產(chǎn)生的樣本，包括完整的糖肽、Endo H處理糖肽、PNGase F處理糖肽，

4、并且通過使用 Byonic和 pFind工具鑒定糖鏈結(jié)構(gòu)和肽段氨基酸序列。由于Endo H特異性識(shí)別高甘露糖和雜合糖結(jié)構(gòu)，而PNGase F則可以切除Endo H消化后剩余的復(fù)合糖結(jié)果。通過第二步和第三步內(nèi)切糖苷酶的連續(xù)消化，所分別獲得的糖肽氨基酸序列信息可以提示糖肽所攜帶的糖鏈的類型，進(jìn)而輔助提高第一步分析中所鑒定到的完整糖肽結(jié)構(gòu)的可靠性和鑒定準(zhǔn)確度。我們通過使用核糖核酸酶B（高甘露糖型）和IgG（復(fù)合糖結(jié)構(gòu)為主）驗(yàn)證了這種方法的有效

5、性，并應(yīng)用這種順序消化策略實(shí)現(xiàn)HepG2細(xì)胞全蛋白中N-糖肽的分析。我們從HepG2細(xì)胞中成功鑒定947個(gè)特異糖修飾肽段的序列、1011個(gè)糖修飾位點(diǎn)、4514個(gè)位點(diǎn)特異性的糖型。同時(shí)獲得特定糖基化肽段上不同糖型的相對譜峰強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了對位點(diǎn)特異性糖型占有率的分析。上述結(jié)果表明我們的方法可用于復(fù)雜樣品中的糖蛋白位點(diǎn)特異性的糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定與定量分析。
　　第三章，針對在腫瘤發(fā)生過程中具有重要標(biāo)志物價(jià)值的核心巖藻糖修飾，基于前期工作基礎(chǔ)，開

6、展了肝癌、肝硬化、正常人血清核心巖藻糖化修飾肽段的大規(guī)模鑒定分析。對蛋白酶切之后得到的肽段，首先使用HILIC進(jìn)行糖肽的富集，然后使用LCH凝集素從得到的糖肽中富集核心巖藻糖修飾的肽段，再使用Endo F3酶切簡化糖修飾肽段，最后通過LC-MS/MS檢測，利用pFind搜庫，可以獲得核心巖藻糖修飾的肽段及其質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度信息。在本研究中，首先將此方法應(yīng)用于 C57小鼠肝臟和血清樣本中蛋白質(zhì)的核心巖藻糖修飾肽段的測試鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明富集的