基于鏈霉親和素的廣譜紫外吸收劑制備.pdf

1、紫外線是位于日光高能區(qū)的不可見光線，按波長可分為UVA、UVB、UVC。合適劑量紫外線可促進(jìn)人體維生素D的合成。過量紫外線的照射則會引起皮膚的不適甚至疾病。因而，對于紫外線的防護(hù)以及防曬劑的開發(fā)逐漸受到廣泛重視，研制廣譜、高效的紫外線阻擋和吸收劑是當(dāng)前防曬研究的熱點之一。
　　鏈霉親和素蛋白(Streptavidin，以下簡稱SA)是從親和素鏈霉菌（Streptomyces avidinii）分泌物中得到的一種蛋白質(zhì)。其單體的二級

2、結(jié)構(gòu)由八條反向平行β-鏈組成，進(jìn)而折疊形成反向平行β-桶形三級結(jié)構(gòu)。其對生物素表現(xiàn)出極強(qiáng)的親和性，每個桶狀亞基都能結(jié)合一個生物素分子。四個相同的鏈霉親和素蛋白單體可締合形成四聚體。鏈霉親和素中，芳香族氨基酸比例達(dá)10.08％，其中色氨酸占比4.20％，其對280nm紫外線具較高消光系數(shù)。且色氨酸可吸收酪氨酸等傳遞的能量釋放熒光。這些最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在340nm附近的紫外線若進(jìn)一步被化合物（例如香豆素類化合物）吸收，即可據(jù)此制成吸收波長涵

3、蓋260～350nm的廣譜紫外吸收劑。
　　本研究通過克隆具有天然活性的核心SA序列，并以之為基礎(chǔ)連接類生物素短肽序列以抑制SA與表達(dá)菌胞內(nèi)生物素的結(jié)合，從而保證宿主生物素正常代謝?？紤]類生物素短肽與生物素結(jié)合位點間距，選取包含八個氨基酸的人鼻病毒3C蛋白酶特異性識別序列LEVLFQGP連接SA與類生物素短肽。以親和素鏈霉菌基因組DNA為模板，經(jīng)PCR獲得長度為357bp的SA片段。再以所得SA為模板，進(jìn)行第二次PCR獲得含有類生

4、物素短肽序列的基因片段SA1。對SA1定點突變(G59K、Y68G、L94K、W105S、H112K)后，即口獲得具高賴氨酸比例的目的序列SA2，以期增加蛋白的可溶性。
　　參考已有研究，選定兩種載體pHND和pET-24a分別對SA2蛋白以0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化，其中對pET-24a載體的SA2誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)，在16℃，16h誘導(dǎo)后，SA2的表達(dá)量更多。比較兩者純化的得率與純度后發(fā)現(xiàn)，pET-24a多聚組氨

5、酸標(biāo)簽融合蛋白在Ni-NTA親和層析的洗脫液中未經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從而確定SA2不適用Ni-NTA純化法。而帶YND標(biāo)簽的融合蛋白SA2不僅表達(dá)量較多，且因其實際上攜帶有兩個標(biāo)簽——多聚組氨酸標(biāo)簽與YND(Yeast3'，5'-Bisphosphate Nucleotidase，酵母3'，5'二核苷酸酶亦稱HAL2)，經(jīng)由兩個親和層析柱Ni-NTA柱與PAP（3'，5'-Bisphosphate adenosine，3'，5'二磷酸腺苷）柱的純化

6、，得到純度較高的目的蛋白SA2。
　　依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，由篩選后得到的香豆素類化合物7-甲氧基香豆素-3-羧酸-N-琥珀酰亞胺酯(7-Methoxycoumarin-3-carboxylic Acid N-Succinimidyl Ester，MCSE)作為UVA吸收劑標(biāo)記SA2，得到MCSE-SA2。熒光光譜顯示，MCSE-SA2可吸收280nm紫外線并釋放405nm熒光。此結(jié)果從側(cè)面證明，SA2蛋白內(nèi)部的色氨酸與標(biāo)記的MCSE

7、發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)。綜上可知標(biāo)記蛋白MCSE-SA2通過色氨酸和MCSE吸收280nm和340nm的紫外線，釋放無害的、波長大于400nm的熒光。出于應(yīng)用考慮，對標(biāo)記蛋白的安全性作了初步說明。結(jié)論為深入探討利用SA蛋白研制防曬劑奠定基礎(chǔ)。
　　標(biāo)記后的鏈霉親和素在分類上屬于生物工程類紫外吸收劑。其除克服傳統(tǒng)化學(xué)物理制劑的缺點外，相較一般生物