乳酸的來源和生成途徑研究及13C對13C標(biāo)記化合物質(zhì)譜行為的影響.pdf

1、背景:
　　乳酸對于腫瘤細(xì)胞的生存和腫瘤診治意義重大，是腫瘤代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，有報(bào)道指出乳酸根離子和氫離子共同作用可以幫助腫瘤細(xì)胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中生存。應(yīng)用這一原理，對肝細(xì)胞癌患者施行肝動脈化療栓塞，將碳酸氫鈉局部灌注到腫瘤中，療效良好，顯著提高了患者生存期。許多研究關(guān)注乳酸對腫瘤細(xì)胞的作用以及在不同條件下乳酸的生成量。目前認(rèn)為乳酸可以由葡萄糖或谷氨酰胺生成，但兩種來源的比例還不清楚。另外，葡萄糖可以經(jīng)糖酵解直接生成乳酸

2、，也可以經(jīng)磷酸戊糖途徑后回到糖酵解生成乳酸，但這兩種路徑生成的乳酸各占乳酸總量的百分之多少還不清楚。本文的初衷是采用基于LC-MS/MS檢測的13C標(biāo)記追蹤法研究乳酸的來源分布和生成途徑分布情況，卻意外發(fā)現(xiàn)13C會影響13C標(biāo)記乳酸的質(zhì)譜行為，到現(xiàn)在為止這一現(xiàn)象還未見報(bào)道，而基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤法在代謝研究領(lǐng)域應(yīng)用得非常廣泛，因此這一發(fā)現(xiàn)具有較大的理論意義，且對基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤法的應(yīng)用也具有指導(dǎo)作用。
　　方法:

3、>　　為了探索細(xì)胞內(nèi)乳酸的來源分布和生成途徑分布情況，本文分別用[U-13C]-、[1，2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[1，2，3-13C3]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖孵育細(xì)胞，用LC-MS/MS檢測培養(yǎng)液中的乳酸和各類13C標(biāo)記乳酸。因意外發(fā)現(xiàn)13C可能會影響13C標(biāo)記乳酸的質(zhì)譜行為，故用LC-MS和LC-MS/MS檢測以下標(biāo)準(zhǔn)品:乳酸、[1-13C]乳酸、[3-13C]乳酸、[2，3-13C2

4、]乳酸和[U-13C]乳酸，并用DFT法計(jì)算乳酸和各類13C標(biāo)記乳酸碎裂途徑中間產(chǎn)物的活化能。另外，為了單純研究葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的乳酸，本文在體外建立無細(xì)胞糖酵解反應(yīng)體系，分別以[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-、[6-13C]-、[1，2-13C2]-和[1，2，3-13C3]葡萄糖為底物，用LC-MS/MS檢測生成的乳酸和各類13C標(biāo)記乳酸。最后，為了探索13C對13C標(biāo)記化合物質(zhì)譜行為的影響是否具有普遍性，本文

5、用LC-MS和LC-MS/MS檢測以下標(biāo)準(zhǔn)品:葡萄糖、[U-13C]葡萄糖、谷氨酰胺和[U-13C]谷氨酰胺。
　　結(jié)果:
　　1.用基于LC-MS/MS的13C追蹤法測定乳酸和各類13C標(biāo)記乳酸的百分比，并計(jì)算乳酸的來源分布和生成途徑分布情況
　　1)用[U-13C]葡萄糖孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中由葡萄糖、其他來源以及混合來源生成的乳酸分別占97％、2％、1％。正常T細(xì)胞中結(jié)果略有差異，以上三種來源生成的乳酸分別占:

6、90％、8％和2％。
　　2)用[1，2-13C2]葡萄糖孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)糖酵解生成的乳酸占90％、經(jīng)磷酸戊糖途徑后返回糖酵解生成的乳酸占6.6％、經(jīng)其他途徑生成的乳酸占2.2％。正常T細(xì)胞中結(jié)果略有差異:經(jīng)以上三種途徑生成的乳酸分別占85％、6.0％和7.9％。
　　3)用[3-13C]葡萄糖孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)糖酵解生成的乳酸占89％、經(jīng)磷酸戊糖途徑后返回糖酵解生成的乳酸占9.2％、經(jīng)其他途徑生成的乳

7、酸占2.2％。正常T細(xì)胞中結(jié)果略有差異:經(jīng)以上三種途徑生成的乳酸分別占84％、8.1％和7.9％。
　　4)葡萄糖經(jīng)糖酵解，1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸應(yīng)當(dāng)?shù)攘浚琜3-13C]葡萄糖組的結(jié)果符合理論，但[1，2-13C2]葡萄糖組的結(jié)果不符合。為進(jìn)一步探索葡萄糖1，2，3位碳原子和4，5，6位碳原子經(jīng)糖酵解生成的乳酸是否等量，分別用[1-13C]-、[6-13C]-、[1，2，3-13C3]-和[4-

8、13C]標(biāo)記葡萄糖孵育細(xì)胞，結(jié)果顯示，經(jīng)糖酵解由葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值不一致，最小為0.85（[6-13C]葡萄糖），最大為1.6（[1，2，3-13C3]葡萄糖）。
　　2.證實(shí)13C影響13C標(biāo)記乳酸的質(zhì)譜行為，并提出基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要校正。
　　乳酸標(biāo)準(zhǔn)品分別與各類13C標(biāo)記乳酸標(biāo)準(zhǔn)品([2,3-13C2]-、[3-13C]-、[U-13C]-和[1-1

9、3C]乳酸)混合，并分別用LC-MS和LC-MS/MS檢測各混合液，發(fā)現(xiàn)13C顯著影響13C標(biāo)記乳酸的碎裂效率，而對離子化效率影響不大。將前文13C標(biāo)記葡萄糖([U-13C]-、[1，2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[6-13C]-、[1，2，3-13C3]-和[4-13C]葡萄糖)孵育細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行校正，并重新計(jì)算乳酸的來源分布和生成途徑分布。校正后，所有結(jié)果均符合理論。
　　3.計(jì)算乳酸碎裂過程中間產(chǎn)物的

10、活化能，并與實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比，提出一個(gè)理論悖論經(jīng)理論計(jì)算，乳酸碎裂過程中過渡態(tài)2（丟CO）是乳酸碎裂的限速步驟。乳酸過渡態(tài)2的活化能小于或等于各類13C標(biāo)記乳酸，由此推論乳酸丟CO的效率等于或大于各類13C標(biāo)記乳酸，這與前文標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，故由此得出一個(gè)悖論。
　　4.體外無細(xì)胞糖酵解系統(tǒng)中，13C標(biāo)記葡萄糖經(jīng)糖酵解1，2，3位碳原子與4，5，6位碳原子生成的乳酸不等，且二者比值與葡萄糖地13C標(biāo)記位置有關(guān)。
　　分別用[1

11、，2-13C2]-、[1，2，3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖作為體外無細(xì)胞糖酵解系統(tǒng)的底物，用LC-MS/MS檢測生成的乳酸和13C標(biāo)記乳酸，校正后，結(jié)果顯示若底物的13C標(biāo)記在1，2，3位碳原子([1，2-13C2]-、[1，2，3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]葡萄糖），由葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值是0.64;若

12、底物的13C標(biāo)記在4，5，6位碳原子([4-13C]-、[6-13C]葡萄糖)，葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值是0.8，理論上不論13C標(biāo)記在什么位置，二者比例都應(yīng)當(dāng)是1，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符，且具有規(guī)律性，其原因還未明確，需要設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　5.13C標(biāo)記影響葡萄糖和谷氨酰胺的質(zhì)譜行為
　　用LC-MS和LC-MS/MS分別檢測葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和[U-13C]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的

13、等濃度混合液以及谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品和[U-13C]谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的等濃度混合液，發(fā)現(xiàn)13C對[U-13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺的碎裂效率均有影響，可見13C對13C標(biāo)記化合物質(zhì)譜行為的影響具有普遍影響。
　　結(jié)論:
　　1)本文首次系統(tǒng)地闡明腫瘤細(xì)胞4T1、Hela、 K562和小鼠胸腺細(xì)胞乳酸的來源分布和生成途徑分布。
　　2)本文首次發(fā)現(xiàn)13C顯著影響了13C標(biāo)記乳酸在質(zhì)譜中的離子化過程和碎裂效率，并發(fā)現(xiàn)13