高效聚磷菌的篩選、ppk基因的克隆及其應(yīng)用研究.pdf

1、水體富營養(yǎng)化是全球十大環(huán)境問題之一。氮磷尤其是磷的輸入是引起水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。城鎮(zhèn)生活污水的排放是水體磷污染的主要來源之一。為解決磷污染所帶來的危害，在污水進(jìn)入水體前進(jìn)行有效處理，降低排放污水的磷濃度十分必要。目前世界各地大規(guī)模污水處理廠主要采用強(qiáng)化生物除磷工藝（EBPR），EBPR工藝具有污泥產(chǎn)生量少、不使用化學(xué)物質(zhì)和運(yùn)行經(jīng)濟(jì)等特征。在EBPR系統(tǒng)中聚磷菌在磷的去除中起著至關(guān)重要的作用。但迄今為止，人們僅分離到Acinetoba

2、cter species、Microlunatus phosphorus Lampropedia spp.、Pseudomonasspp.等屬的為數(shù)不多的PABs，而且這些菌純培養(yǎng)時很少能表現(xiàn)出EBPR系統(tǒng)典型聚磷菌的厭氧特征，有關(guān)聚磷菌的工程化應(yīng)用尚無報道；同時，由于微生物學(xué)家和工程專家結(jié)合不緊密，加之EBPR系統(tǒng)本身的復(fù)雜性，對EBPR的微生物學(xué)機(jī)理和分子機(jī)理了解不多，導(dǎo)致EBPR的穩(wěn)定運(yùn)行難以控制和整個生物聚磷研究進(jìn)展不快。為此，

3、加大聚磷菌的篩選力度，對聚磷菌的聚磷特性和聚磷關(guān)鍵基因，對聚磷菌的工程化應(yīng)用進(jìn)行研究十分必重要。
　　 本文以高效聚磷菌聚磷機(jī)理研究為主線，從高效聚磷菌的篩選著手，系統(tǒng)研究了高效聚磷菌的生物學(xué)特性、聚磷特性、與聚磷相關(guān)的ppk基因、高效菌株GM6的定殖及其強(qiáng)化廢水生物除磷能力探索了GM6的工程化應(yīng)用前景，構(gòu)建了國內(nèi)生物除磷研究的技術(shù)平臺，取得了目前國內(nèi)污水強(qiáng)化生物除磷基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域較為豐富的研究成果。
　　 一.聚磷

4、菌的篩選及生物學(xué)特性
　　 改進(jìn)了高效聚磷菌的篩選方法，篩選出了四株聚磷能力遠(yuǎn)高于國外報道的野生菌株聚磷水平的高效聚磷株：采取大通量高流量的原則，采用平板梯度稀釋涂布、poly-P和PHB染色和藍(lán)白斑篩選獲得初選聚磷菌25株；經(jīng)好氧和厭氧培養(yǎng)確定了四株高效聚磷菌GM1、GM6、GM18和GM21，選擇GM1和GM6作為研究材料。經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析和同源性比較，GM1被初步鑒定為弗氏檸檬酸桿菌（Citroba

5、cler freundii）；GM6被初步鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。
　　 GM1在合成廢水中生長時，最適初始pH為7.0，最適生長溫度為30℃，當(dāng)初始pH值大于8.5或小于5.5時或當(dāng)溫度小于5℃或大于33℃時生長較慢；GM6在合成廢水中培養(yǎng)時，最適起始pH為6.5，最適生長溫度為27℃，當(dāng)初始pH值大于8.0或小于5.0時，或當(dāng)溫度小于5℃或大于37℃時生長較慢；裝液量對GM1和GM6生長影

6、響不大。
　　 二.GM1和GM6的聚磷特性
　　 GM1和GM6純培養(yǎng)時表現(xiàn)出了典型PABs的特征，為生物除磷研究提供了寶貴的材料：GM1和GM6在合成廢水中培養(yǎng)時，除磷最適初始pH值分別為6.5和7.0，當(dāng)pH值小于5.5或大于7.5時，除磷能力均下降。GM1和GM6的最適除磷溫度為20℃和27℃；當(dāng)溫度大于30℃或小于10℃時，GM1除磷效果明顯變差；當(dāng)溫度大于33℃或小于5℃時，GM6的除磷效果明顯變差。GM1和

7、GM6對合成廢水、MOPS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基及YG培養(yǎng)基的好氧磷去除率分別在60％-89.6％和63％-96.6％之間（對照菌E.coli的去除率在13.6％-30.8％之間）。GM6的聚磷和放磷能力更強(qiáng)。當(dāng)以乙酸為底物好氧培養(yǎng)時：GM1和GM6體內(nèi)能聚集類脂粒PHB，菌體PHB濃度上升與乙酸的濃度下降呈負(fù)相關(guān)；GM1、GM6厭氧培養(yǎng)時，底物乙酸濃度下降與菌體PHB的上升和磷濃度的增加呈負(fù)相關(guān)；在起始1h內(nèi)乙酸的吸收及磷的釋放速度較快，

8、隨著乙酸的吸收和poly-P的分解，上清液中乙酸濃度下降，磷的濃度上升，兩者呈負(fù)相關(guān)。
　　 三.GM6（Pseudomonas putida）聚磷酸鹽激酶基因ppk的克隆及表達(dá)
　　 國內(nèi)首次克隆了聚磷菌的ppk基因，對ppk基因進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)菌株的除磷效率較高。本研究根據(jù)ppk基因的保守區(qū)設(shè)計引物，從GM6的總DNA中擴(kuò)增到ppk基因的528bp的片段，隨后采用一種新型的擴(kuò)增未知序列的PCR技術(shù)SEFA-PCR擴(kuò)增

9、片段的上下游基因序列，將擴(kuò)增的片段和擴(kuò)增的上下游序列進(jìn)行拼接，用Omiga軟件進(jìn)行開放閱讀框分析，預(yù)測ppk基因全長為2220bp。其上游為HemB基因，長度可能為1119bp。將GM6的ppk基因序列與其它已報道的ppk基因進(jìn)行同源性比較，GM6與Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas syringae、Klebsiella aerogenes

10、、Neisseria meningitidis、Acinetobactersp.ADP1和Escherichia coli K12-MG1655在核對苷酸水平的同源性分別為82％、79％、84％、45％、63％、53％和22％；與Pseudomonas putida KT2440、Acinetobacter.sp.ADP1、Escherichia coli K12-MG1655、Neisseria meningitidis MC58和P

11、seudomonas aeruginosa PAO1在氨基酸水平的同源性分別為89％、58％、33％、50％和80％。
　　 構(gòu)建的表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）/pET29a-ppk經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h時，獲得了ppk基因的表達(dá)產(chǎn)物，其分子量約81 kDa。表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）/pET29a-ppk12h的磷去除率高達(dá)80％（而對照菌株磷去除率僅為18％），遠(yuǎn)高于國外報道的40％的磷去除率。表明pp

12、k基因在E.coli中的過量表達(dá)，導(dǎo)致了E.coli菌體中poly-P的大量聚集，從而使得培養(yǎng)基中的磷酸鹽大量的去除。
　　 四.高效聚磷菌GM6在活性污泥中的定殖及強(qiáng)化生物除磷應(yīng)用研究
　　 首次將高效菌株進(jìn)行了工程應(yīng)用，獲得了快速強(qiáng)化廢水生物除磷的能力。利用三親接合對高效聚磷菌GM6進(jìn)行標(biāo)記，獲得gfp基因標(biāo)記菌株GMTR。試驗表明，應(yīng)在厭氧起始時投加菌株，當(dāng)接種量小于1％時，GMTR投菌后難以獲得生長優(yōu)勢；接種量達(dá)

13、到2％時，在裝置運(yùn)行12個循環(huán)后，按2％-7.5％四種不同的接種比例投菌時污泥中GMTR的比例相差不大。因此，實際投菌時，確定比例為2％。GMTR在R2中的定殖情況是：在R2的污泥中檢出了GMTR，而對照R1污泥中在抗性平板上培養(yǎng)時末檢出。投加GMTR至R2后，R2運(yùn)行21d時，GMTR的比例升至9.2％，GMTR的菌數(shù)已占據(jù)優(yōu)勢。投加GMTR菌株后，磷的去除率逐漸提高，運(yùn)行21d時磷的去除率升至96％，28d后出水濃度穩(wěn)定在0.2 m

14、gL-1左右。運(yùn)行21d時，裝置R2的厭氧和好氧污泥具備了EBPR的典型特征，厭氧1h，能快速放磷除有機(jī)物，好氧2h能有效除磷。因此，投加GM6能快速啟動和恢復(fù)強(qiáng)化生物除磷能力。選擇除磷能力較差的生活污水處理設(shè)施，利用GM6來強(qiáng)化其除磷能力，按2％比例投菌，投菌6d后，出水磷濃度逐漸下降，至25d時，出水磷濃度小于0.5 mg L-1，磷的去除率達(dá)96.8％。因此，GM6強(qiáng)化生物除磷效果顯著。
　　 五.影響EBPR系統(tǒng)生物除磷

15、的主要因素
　　 研究了進(jìn)水乙酸濃度、厭氧生境、進(jìn)水pH、好氧溶氧濃度及污泥泥齡對EBPR系統(tǒng)除磷效果的影響。厭氧45min時，釋磷量隨著進(jìn)水中乙酸比例增加逐漸增大，僅以葡萄糖為碳源時釋磷量僅為2.25 mgL-1，乙酸比例為15％時釋磷量為16.69 mg L-1，乙酸比例大于30％時釋磷量基本不變；厭氧120min時，進(jìn)水乙酸比例對于磷釋放量影響不大。過高的厭氧攪拌轉(zhuǎn)速對厭氧釋磷有影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時磷釋放量下降。對系統(tǒng)釋磷而

16、言，最適pH6.5，當(dāng)進(jìn)水pH大于7.0或小于6.0時，磷釋放量均下降，當(dāng)pH大于7.5時，磷的釋放量大幅下降。對系統(tǒng)磷去除率而言，進(jìn)水最適pH為6.5，當(dāng)進(jìn)水pH超過7.0時，系統(tǒng)對磷的去除效率迅速下降，當(dāng)pH值為8.0時的磷去除率僅為39.7％，系統(tǒng)失去了強(qiáng)化生物除磷能力。曝氣強(qiáng)度對出水中CODcr濃度的影響較小，但其對出水磷濃度影響較大，當(dāng)曝氣強(qiáng)度使DO達(dá)到2.10 mg L-1時，出水磷濃度下降到0.26mg L-1的水平。污泥