PLGA-TCP支架材料的不同三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)骨缺損部位神經(jīng)化影響的研究.pdf

1、骨缺損，作為直接或間接暴力所導(dǎo)致的嚴(yán)重骨組織損傷，一直是骨科學(xué)界研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。尤其是近十年間，隨著地震傷、交通傷和骨腫瘤病人的日益增加，由此導(dǎo)致的大段骨缺損病人的治療、預(yù)后和并發(fā)癥等更加成為困擾骨外科醫(yī)生的難題。因此，摸索出一條有效促進(jìn)缺損修復(fù)的方法已成為骨科學(xué)術(shù)界不得不面臨的問(wèn)題之一。早期，在治療骨缺損過(guò)程中，往往采用傳統(tǒng)的手術(shù)和外固定架等方法對(duì)骨缺損病人進(jìn)行治療。這些治療方法雖然對(duì)小段骨缺損效果較明顯，但對(duì)大段骨缺損的治療效果并

2、不理想。隨著組織工程學(xué)治療理念的提出和發(fā)展，為解決骨缺損尤其是大段骨缺損的修復(fù)治療問(wèn)題提供了有力的契機(jī)。近年來(lái)，骨組織工程的研究在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中雖取得了一定的成果，但總體仍停留在實(shí)驗(yàn)室水平。實(shí)驗(yàn)最終在新生骨組織形成的數(shù)量和質(zhì)量上均遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期的效果，臨床應(yīng)用與傳統(tǒng)治療方法相比優(yōu)勢(shì)并不明顯。因此尋找能夠有效提高大段骨缺損修復(fù)的方法是目前亟待解決的難題。
　　血管化作為近年來(lái)組織工程骨研究中的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外學(xué)者均取得了喜人的研究

3、成果。支架材料的結(jié)構(gòu)因素對(duì)于組織工程骨的血管化影響已經(jīng)得到了證實(shí)。具有良好孔間連通的孔隙結(jié)構(gòu)有利于組織工程骨的血管化。這些成果雖然一定程度上解決了組織工程骨的血管化問(wèn)題，但在修復(fù)效果上仍不理想，主要表現(xiàn)為材料的力學(xué)性能較差等問(wèn)題，距離臨床應(yīng)用還有差距。因此，考慮在骨組織工程研究當(dāng)中是否還有其它關(guān)鍵的問(wèn)題尚待解決呢？進(jìn)行了大量文獻(xiàn)閱讀和預(yù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，在正常的骨組織和髓腔內(nèi)有大量的神經(jīng)纖維分布，神經(jīng)調(diào)節(jié)在骨的正常代謝及改建中起到了重要的作用

4、。骨折部位在缺乏神經(jīng)支配的情況下，雖然有骨痂生長(zhǎng)，但相對(duì)于正常的骨折再生骨痂來(lái)說(shuō)，其質(zhì)量和生物力學(xué)強(qiáng)度均明顯不足。因此，考慮組織工程骨的神經(jīng)再支配，即組織工程骨的神經(jīng)化問(wèn)題可能是組織工程骨修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這一問(wèn)題也許就是解決和完善組織工程骨修復(fù)質(zhì)量的新靶點(diǎn)。
　　隨著材料-生物學(xué)的發(fā)展，支架材料作為組織工程三要素中最為重要的組成部分，已被證實(shí)其特殊的三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)于組織工程骨的成骨和血管化均有重要影響。有研究發(fā)現(xiàn)，支架材

5、料的三維空間結(jié)構(gòu)可以影響局部功能細(xì)胞的粘附、增殖和遷移，具有定向結(jié)構(gòu)的支架材料更有助于體內(nèi)周圍神經(jīng)再生。因此，設(shè)想支架材料的三維空間結(jié)構(gòu)有可能通過(guò)影響神經(jīng)功能細(xì)胞的遷移、增殖進(jìn)而影響組織工程骨神經(jīng)化的進(jìn)程，最終影響骨組織的再生修復(fù)。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用低溫沉積技術(shù)制備出具有不同三維空間結(jié)構(gòu)的PLGA/TCP支架材料。在體外復(fù)合細(xì)胞后，觀察具有神經(jīng)功能的雪旺細(xì)胞是否會(huì)因三維空間結(jié)構(gòu)的變化影響其增殖、粘附及分化等生物學(xué)行為。在體

6、內(nèi)將支架材料植入動(dòng)物股骨髁部缺損后，觀察缺損部位神經(jīng)的長(zhǎng)入情況和組織修復(fù)情況，找到最適合神經(jīng)化的支架材料結(jié)構(gòu)并探討其作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　第一部分利用低溫沉積技術(shù)制備不同孔徑的PLGA/TCP支架材料
　　方法：采用低溫沉積技術(shù)制備出具有不同孔徑和孔隙率的PLGA/TCP支架材料。應(yīng)用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)大孔徑和小孔徑支架材料的孔徑和孔隙率進(jìn)行觀察測(cè)量并對(duì)支架材料的親水性和生物力學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)和比較。最后，

7、通過(guò)正常培養(yǎng)基與支架材料浸提液的對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果：大孔徑組的孔徑和孔隙率明顯大于小孔組。低溫沉積結(jié)合3D打印制備的PLGA/TCP支架材料的平均吸水率為2.2％±0.1%。細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，材料浸提液的PH值變化不大；與正常培養(yǎng)基組相比，細(xì)胞生存率有所下降。
　　結(jié)論：低溫沉積技術(shù)制備的不同孔徑的PLGA/TCP支架材料基本滿足實(shí)驗(yàn)需要。大孔徑和小孔徑支架材料達(dá)到實(shí)驗(yàn)對(duì)孔徑和孔隙率的要求。材料親水

8、性較好有利于細(xì)胞的粘附。細(xì)胞毒性檢測(cè)材料PH值適宜細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞生存率有所下降，考慮與材料的有機(jī)溶劑1，4-二氧六環(huán)有關(guān)。
　　第二部分體外比較不同孔徑結(jié)構(gòu)的PLGA/TCP支架材料對(duì)雪旺細(xì)胞的影響
　　方法：選擇1-3天 SD大鼠乳鼠，從其體內(nèi)截取坐骨和臂叢神經(jīng)進(jìn)行雪旺細(xì)胞（Schwann Cells， SCs）原代培養(yǎng)并取Ⅱ代細(xì)胞進(jìn)行純化。通過(guò)滴注法，將純化后的雪旺細(xì)胞接種于不同孔徑的PLGA/TCP支架上。利用掃描電鏡

9、觀察細(xì)胞在不同孔徑PLGA/TCP支架材料上的粘附形態(tài)和生長(zhǎng)情況；BrdU標(biāo)記不同孔徑PLGA/TCP支架材料上細(xì)胞繁殖情況；CCK-8法檢測(cè)不同孔徑PLGA/TCP支架材料上細(xì)胞的增殖情況；酶聯(lián)免疫法（Elisa）和RT-PCR檢測(cè)法觀察不同孔徑PLGA/TCP支架材料上SCs分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)生長(zhǎng)因子（GDNF）和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（Ncam）的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：掃描電鏡結(jié)果顯示材料表面微孔明顯

10、，大孔徑組孔徑周邊生長(zhǎng)的細(xì)胞增殖、遷移均明顯優(yōu)于小孔徑組，但小孔徑組上的細(xì)胞黏附性更強(qiáng)。激光共聚焦顯微鏡觀察BrdU染色結(jié)果顯示大孔徑組孔徑周圍的細(xì)胞數(shù)量明顯多于小孔徑組。CCK-8結(jié)果顯示24h兩組細(xì)胞增殖未見(jiàn)顯著差異。48h后，大孔徑組細(xì)胞增殖明顯優(yōu)于小孔徑組。酶聯(lián)免疫法和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，大孔徑組NGF、GDNF和Ncam的表達(dá)均高于小孔徑組。
　　結(jié)論：孔徑在100-300μm的支架材料復(fù)合SCs后

11、，雖然早期刺激了細(xì)胞的增殖、遷移和分化，但最終因?yàn)椴牧媳旧斫Y(jié)構(gòu)的限制，SCs的細(xì)胞生物學(xué)行為受到抑制?？讖皆?00-600μm的支架材料復(fù)合 SCs后，早期雖然細(xì)胞基數(shù)不足，SCs釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子數(shù)量較小孔徑組少，促細(xì)胞的增殖、遷移和分化能力也較弱，但隨著細(xì)胞數(shù)量逐步增加和材料本身的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了 SCs各項(xiàng)能力的提升。因此，具有不同三維空間結(jié)構(gòu)的支架材料可以影響 SCs的細(xì)胞生物學(xué)行為，其中，大孔徑材料更有利于細(xì)胞的增殖、遷移和分

12、化能力的提升。同時(shí)，大孔徑材料的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)也有可能促進(jìn)了局部的血管化和成骨效能。這就為體內(nèi)觀察比較不同三維空間結(jié)構(gòu)支架材料的神經(jīng)化能力打下了理論基礎(chǔ)。
　　第三部分體內(nèi)比較不同孔徑結(jié)構(gòu)的 PLGA/TCP支架材料在修復(fù)兔股骨髁部骨缺損過(guò)程中的神經(jīng)化研究
　　方法：將不同孔徑PLGA/TCP支架材料植入成年新西蘭大白兔股骨外上髁缺損部位，于術(shù)后2周、4周、8周和12周分別灌注后取材，然后應(yīng)用掃描電鏡、免疫熒光染色、Bielsch

13、owshy染色和血清酶聯(lián)免疫等方法對(duì)樣本進(jìn)行處理和觀察，探討不同三維空間結(jié)構(gòu)的骨組織支架材料對(duì)缺損部位神經(jīng)化和成骨的影響。
　　結(jié)果：術(shù)后大體觀察切口愈合良好且大部分動(dòng)物均可正?；顒?dòng)。相同時(shí)間進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，大孔徑組較小孔徑組支架材料的降解速度快。組織學(xué)結(jié)果顯示2周至4周時(shí)骨膜進(jìn)入孔徑內(nèi)，其中大孔徑組孔徑內(nèi)的骨膜組織多于小孔徑組。8周時(shí)，小孔徑組支架材料內(nèi)的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯增加。免疫熒光染色結(jié)果顯示，術(shù)后早期，大孔徑組內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)

14、及其受體表達(dá)明顯，而小孔徑組支架材料的孔徑內(nèi)只有少量點(diǎn)狀分布的神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)。直至4周，小孔經(jīng)組孔徑內(nèi)才有大量神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的陽(yáng)性反應(yīng)。8周至12周時(shí)，兩組新生骨組織周圍除神經(jīng)肽類物質(zhì)外，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)逐漸減弱。血清中神經(jīng)肽類物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，2周至4周，除小孔徑組，大孔徑組和正常組的P物質(zhì)和NPY的表達(dá)均升高。4周至8周，大孔徑組的NPY表達(dá)升高，小孔徑組表達(dá)未見(jiàn)顯著差異。8周至12周，大孔徑組P物質(zhì)和NPY的表達(dá)明顯高于其他組。大

15、孔徑組在12周時(shí)的上升水平也較小孔徑組明顯。
　　結(jié)論：通過(guò)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)不同三維空間結(jié)構(gòu)的PLGA/TCP支架材料中，大孔徑組支架材料具有良好的降解速度和骨膜誘導(dǎo)特性。與此同時(shí)，還證明了神經(jīng)化程度與骨形成的速度是成正比的，神經(jīng)化程度越高，神經(jīng)遞質(zhì)釋放越明顯，成骨速度越快。大孔徑組除具有良好的神經(jīng)誘導(dǎo)性，還有很好的成骨作用。由于小孔徑支架材料的降解最終改變了其內(nèi)部三維空間結(jié)構(gòu)，促使材料內(nèi)神經(jīng)組織釋放出足夠多的神經(jīng)遞質(zhì)，從而加快了小孔