重組蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及成絲機(jī)理研究.pdf

1、蛛絲蛋白纖維作為一種優(yōu)異的生物學(xué)材料，在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值，已有研究表明，重組蛛絲蛋白可用作血管、神經(jīng)導(dǎo)管及藥物載體等。目前重組蛛絲蛋白的研究主要集中于牽引絲、次壺腹腺絲及鞭毛狀腺絲蛋白質(zhì)。缺少梨狀腺絲蛋白（ Pyriform Spidroin, PySp）的研究，尤其是大腹園蛛(A. ventricosus)梨狀腺絲蛋白的編碼序列至今仍未有報(bào)道，其生物學(xué)功能仍有待研究。為了解析大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復(fù)區(qū)（Rp）的功

2、能、研究C端非重復(fù)區(qū)（CT）對(duì)成絲機(jī)理的影響、測(cè)試?yán)鏍钕俳z素蛋白的力學(xué)性能、獲得一種材料學(xué)性能優(yōu)良的重組蛛絲蛋白、為蛛絲蛋白的仿生提供理論依據(jù)，本課題開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究工作并都取得了較理想的研究結(jié)果。
　?。?）以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腹園蛛基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，克隆獲得一段蛛絲蛋白編碼序列，通過(guò)Blast比對(duì)分析，確定該序列包含大腹園蛛梨狀腺絲（Piriform spidroin，PySp）的一段完整重復(fù)區(qū)（Rp）的

3、編碼序列，該序列為A. ventricosus的首條完整的PySp重復(fù)區(qū)基因序列，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)A. ventricosus絲蛋白編碼基因克隆的空白，為絲蛋白基因的研究增填了新成員。
　　（2）將PySp-Rp模塊與MiSp-NT/CT模塊重組構(gòu)建不具有CT功能模塊的MiSpNT-PySpRp與具有完整功能模塊的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，并且優(yōu)化兩種蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)SDS-

4、PAGE膠和Western-blot鑒定，兩種重組蛛絲蛋白均能在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)量較高，形成包涵體，經(jīng)過(guò)變性純化，獲得了純度較高的重組蛛絲蛋白。
　?。?）采用圓二色譜（Circular dichroism, CD）測(cè)定不同pH下兩種重組蛛絲蛋白溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)，計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量的變化；使用傅里葉紅外光譜（ATR-FTIR）測(cè)定兩種重組蛛絲蛋白凍干后的紅外光譜，計(jì)算其酰胺Ⅰ帶的各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量。比較兩種蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)

5、構(gòu)組成發(fā)現(xiàn)，隨著pH值降低，CT結(jié)構(gòu)域會(huì)引發(fā)PySp二聚化促進(jìn)其成絲；紅外光譜顯示，CT結(jié)構(gòu)域會(huì)增加PySp纖維的β折疊的百分含量，揭示了C端非重復(fù)區(qū)的存在可促進(jìn)絲素蛋白質(zhì)的組裝成絲，有利于提高固著絲纖維機(jī)械性能。
　?。?）使用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察濕紡獲得的 MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維的表面形態(tài)，顯示濕紡形成的 MiSpNT-PySpRp-