基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的熒光生物傳感器及其應(yīng)用于microRNA檢測研究.pdf

1、本文詳細(xì)介紹了microRNA（miRNA）的功能及檢測方法、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及熒光光譜檢測技術(shù)等，同時(shí)將核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引入熒光生物傳感器的構(gòu)建中，對多種miRNA進(jìn)行了超靈敏檢測。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，構(gòu)建了一種基于支鏈滾環(huán)擴(kuò)增耦合內(nèi)切酶信號(hào)放大作用的熒光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)miRNA-155的超靈敏分析。當(dāng)在目標(biāo)物miRNA-155存在的情況下，miRNA-155首先將發(fā)夾探針1打開，引發(fā)主干滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物打開發(fā)夾探針2后引發(fā)

2、支鏈滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。該支鏈滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物將分子信標(biāo)打開后形成了Nb.BbvCI的作用位點(diǎn)，進(jìn)而引發(fā)Nb.BbvCI對分子信標(biāo)的循環(huán)切割反應(yīng)，最終使得大量分子信標(biāo)被切斷并極大地增強(qiáng)了熒光信號(hào)強(qiáng)度和檢測的靈敏度。
　　在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)而且操作非常簡單的熒光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對miRNA-122的超靈敏分析檢測。當(dāng)在目標(biāo)物miRNA-122存在的情況下，其首先與發(fā)夾探針結(jié)合進(jìn)而與輔助探針結(jié)合，在phi29

3、DNA聚合酶和Nb.BbvCI的作用下實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物miRNA-122的循環(huán)利用、Nb.BbvCI作用位點(diǎn)的形成、次級目標(biāo)物的形成和循環(huán)利用，同時(shí)也產(chǎn)生了許多作為滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)引物的單鏈DNA分子。該引物分子與環(huán)狀模板DNA結(jié)合后引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，其產(chǎn)物又能夠?qū)⒎肿有艠?biāo)打開并形成Nb.BbvCI的作用位點(diǎn)，從而在Nb.BbvCI的作用下對結(jié)合在滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物上的分子信標(biāo)進(jìn)行循環(huán)切割作用，使得大量發(fā)夾型的分子信標(biāo)被切斷并極大地增強(qiáng)了熒光信號(hào)強(qiáng)度