木霉誘導(dǎo)黃瓜對(duì)枯萎病的抗性機(jī)制及相關(guān)miRNA分析.pdf

1、黃瓜枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中發(fā)病較重的土傳病害，主要以土壤為傳播媒介，防治難度大。木霉對(duì)多種病原菌引起的土傳病害具有較好的防治效果。植物miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答各種非生物脅迫。目前木霉誘導(dǎo)的黃瓜枯萎病抗性機(jī)制尤其是 miRNA在其中的作用尚不明確。本研究首先篩選了對(duì)枯萎病菌拮抗作用較強(qiáng)的木霉菌株，分析了木霉菌通過(guò)調(diào)控活性氧(ROS)和對(duì)根系細(xì)胞周期影響從而提高對(duì)黃瓜枯萎病的拮抗機(jī)制，最后對(duì)木霉誘導(dǎo)的miR

2、NA進(jìn)行了分析。結(jié)果如下：
　　1．采用平板對(duì)峙法，利用T11、T22、T24、TM、T28、T1546株木霉，篩選得到對(duì)黃瓜枯萎病具有較高拮抗活性的木霉 TM，其抑菌率為78.05％，經(jīng)測(cè)定，木霉TM易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)枯萎病菌抑制率達(dá)72.5%，難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)枯萎病菌抑制率為61.73%。
　　2．分析了預(yù)接種木霉對(duì)枯萎病菌侵染的黃瓜根系中的ROS含量的影響，與對(duì)照相比，預(yù)接種木霉黃瓜根中的H2O2含量增加了39.49

3、％；只接種枯萎病菌的黃瓜根中H2O2和O2-含量顯著增高，分別比對(duì)照植物高3.55倍和8.10倍。而先預(yù)接種木霉然后再侵染枯萎病菌的處理，根中 H2O2和 O2-含量明顯降低，比只用枯萎病菌處理降低53.92％和57.31％。
　　3．為分析細(xì)胞周期調(diào)節(jié)在木霉提高枯萎病抗性中的作用機(jī)制，測(cè)定了6個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因在黃瓜根系中的表達(dá)。接種枯萎病菌導(dǎo)致黃瓜根系細(xì)胞死亡，細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)水平均明顯降低，而先接種木霉的處理則誘導(dǎo)了與

4、細(xì)胞周期相關(guān)基因的顯著上調(diào)。與只接種枯萎病菌相比， CDKA、CDKB、CycA、CycB、CycD3;1和 CycD3;2的表達(dá)水平分別增加2.39、3.58、7.65、5.81、1.98和3.43倍，表明木霉接種可以誘導(dǎo)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因明顯上調(diào)，從而提高了根系細(xì)胞生活力。
　　4．構(gòu)建黃瓜小RNA文庫(kù)，并利用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，對(duì)照處理、接種枯萎病菌處理、先接種木霉再接種枯萎病菌處理、

5、接種木霉處理分別獲得了63781366條、52040096條、54159164條和42093177條的純凈測(cè)序 reads?？偣埠Y選出92個(gè)已知 miRNA，預(yù)測(cè)到63個(gè)新miRNA。與對(duì)照相比，枯萎病侵染處理的黃瓜根系中有62個(gè) miRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化；將先接種木霉再接種枯萎病菌處理與只接種枯萎病菌處理進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，有60個(gè) miRNA發(fā)生了顯著性變化。堿基分布統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，四個(gè)小RNA文庫(kù)中在植物中含量較多的長(zhǎng)度為21

6、nt和22 nt的新miRNA序列首位點(diǎn)堿基 U所占比例較大；在序列堿基11位點(diǎn)，四個(gè)樣品的新 miRNA序列的堿基都偏向于 A，符合 miRNA序列特征，說(shuō)明新 miRNA序列的預(yù)測(cè)結(jié)果可行性高。針對(duì)篩選出的9個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA，利用qRT-PCR對(duì)其表達(dá)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證，相符率達(dá)到了94.2%，表明測(cè)序結(jié)果可靠性較高。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)枯萎病菌進(jìn)行了分子鑒定，篩選出拮抗作用較強(qiáng)的木霉菌株 TM，研究了枯萎病侵染的情況下